臨床診斷中的FISH檢測

FISH（即熒光原位雜交）技術作為分子診斷的重要工具，在科研和臨床診斷領域都有著廣泛的應用。FISH檢測是利用熒光基團標記DNA探針，再將標記的DNA探針與樣本DNA進行原位雜交，最后在熒光顯微鏡下對熒光信號進行計數，以此作為診斷的依據。FISH的操作簡便快捷，結果直觀準確，因此FISH成了許多疾病診斷的首選工具。下面我們將從探針的設計，樣本的制備，原位雜交和檢測結果的觀察等幾個方面簡單介紹FISH的操作。

探針是FISH檢測靈敏度和準確性的關鍵。FISH檢測的準確性來源于探針的設計。FISH能否應用于某一領域也取決于是否具有相應的探針。用于FISH檢測的探針必須具備很高的特異性，能特異性地識別特定的基因或染色體上特定的片斷。而且FISH的探針必須能經受原位雜交的處理而不變性。熒光基團的標記也直接影響了檢測的靈敏度和原位雜交結果的檢測方式。

以著名的探針生產商Vysis公司的LSI系列探針為例：LSI系列探針來源于BAC大片斷基因組文庫，探針所覆蓋的染色體片斷總長可達100Kb-400Kb，保證了探針的高特異性和極強的熒光信號；熒光基團采用直接標記法標記，不同波長的熒光基團使探針在熒光顯微鏡下呈現多種熒光信號，借此我們可以一次檢測多個染色體或基因的異常；由于探針具有極強的熒光信號因而對FISH結果的檢測也采用直接檢測法，即在熒光顯微鏡下直接觀察FISH的信號，而無需抗原-抗體反應對熒光信號進行放大。Vysis探針的設計既確保了探針的特異性和靈敏度，同時直接的鏡檢也使FISH檢測更簡便。

FISH檢測對被測樣本沒有特殊的要求。可以是來自骨髓的細胞，也可以是來自羊水的細胞；可以是冰凍切片的樣本，也可以是經過石蠟包埋的樣本。甚至可以利用尿液樣本進行膀胱癌復發的預后。獲取的樣本細胞也無需經過培養擴增，FISH檢測可以顯示單個細胞核內染色體的異常情況。

我們以Vysis公司的AneuVysion多色DNA探針試劑盒為例，簡要介紹FISH的原位雜交過程。AneuVysion多色DNA探針試劑盒用于羊水細胞的產前診斷，樣本是來源于羊水的細胞。試劑盒通過兩組5種探針（LSI13/21和CEP18/X/Y）同時檢測5個染色體的數目異常，以此為依據進行產前診斷。

樣本的制備

1. 1000轉/分離心羊水（AF）5分鐘。羊水應沒有血色或褐色。

2. 用2-5ml的1×胰酶/EDTA溶液（0.05%胰酶，0.53MEDTA4Na的Hank氏平衡鹽溶液，不含CaCl2、MgCl2.6H2O、MgSO4.7H2O）懸浮沉淀，37℃水浴15分鐘以上

3. 1000轉/分離心5分鐘

4. 用2-5ml的0.56%KCl溶液懸浮細胞，37℃水浴20分鐘。這些處理步驟的目的是使羊水細胞成為懸浮的單細胞。

5. 加0.8-2ml的固定液（3∶1甲醇∶冰醋酸）至細胞低滲液中，輕輕混勻

6. 1000轉/分離心懸液5分鐘，用1ml新的固定液重新懸浮細胞。4℃保存固定的樣本30分鐘以上，直至FISH檢測前。若要長期保存，-20℃保存在固定液中

7. 制片前根據懸浮細胞數調整懸液的體積。若儲存時間超過一個月以上，在制片前用固定液清洗細胞

8. 直接滴加細胞懸液至1-2片預冷的玻片上，每片2個雜交區（每個區域15-25霯細胞懸液）

樣本的老化（目的是為了使FISH達到最佳效果）

1. 將樣本片子放入2×SSC 37℃1小時

2. 將片子放入新制的胃蛋白酶工作液中（20ul 10%胃蛋白酶溶液中加入40ml0.01NHCl）37℃13分鐘

3. 用磷酸鹽平衡液（PBS）室溫下清洗5分鐘

4. 將片子放入快速固定液（0.95%甲醛：1ml的37%甲醛，0.18gMgCl2和39ml的PBS，4℃保存，一個月內使用）室溫5分鐘

5. 在室溫下用PBS清洗5分鐘

6. 晾干片子。為了加速晾干可以用帶棉塞的巴氏移液管吹打玻片

7. 將片子浸泡在70%的乙醇中。用乙醇沖洗1分鐘

8. 從70%乙醇中取出，依次放入85%、100%乙醇中重復以上步驟

9. 根據需要降解片子