高通量測序技術在腸道菌群多樣性研究中的應用

在人體腸道中生活著數以萬億的共生菌群，它們的種類繁多，可達上千種，數量也很驚人，是人體細胞總量的10倍以上，迄今為止，仍有80%以上的微生物不為人知。這些腸道微生物和人體存在著互利共生的關系，對于維持人類的健康發揮著重要的作用。它們在腸道中保持著一種動態的平衡，能夠合成維生素、幫助人體從食物中吸收營養、維持腸道免疫系統功能、抵擋有害微生物的侵害，但是當這種平衡因某些因素被打破致使腸道菌群發生紊亂時，人體就可能患上諸如肥胖癥、糖尿病、腸炎甚至癌癥等疾病。為了加深對人類疾病發生原因、藥物作用機理的理解，繼人類基因組計劃之后，科學家們又啟動了人類元基因組計劃，這使腸道菌群的研究迎來了一個新的浪潮。

在以往的腸道微生物群落多樣性研究中，人們主要采用DGGE等分子生物學方法及生物芯片對腸道菌群進行研究，但是這些方法都存在一定的缺陷。如DGGE只能檢測到環境樣品中十幾種優勢菌，但是對痕量微生物卻束手無策；電泳條帶中包含不只一種16S rDNA序列，要獲悉具體的菌種信息，還需進行克隆、測序，實驗操作繁瑣；此外，采用這種方法不能反映微生物的豐度情況。而生物芯片通過固定在芯片上的探針來獲得微生物多樣性的信息，“只能驗證已知，卻無法探索未知”，通過信號強弱判斷微生物的豐度也不是非常的準確。新一代高通量測序技術自2005年問世以來，以其數字化信號、高數據通量、高測序深度、高準確率等特點，已被廣泛的應用于腸道菌群的研究中，發表的論文達60多篇，其中不乏發表于Nature、PNAS、Genome Res、Gut、Gastroenterology等國際頂尖雜志上的文章。Roche 454測序平臺由于讀長較長，達300～500bp，能跨越16S rDNA序列一個或幾個可變區，是微生物多樣性研究的最佳平臺，使用該平臺發表的關于腸道菌群的論文達50多篇。美吉生物擁有Roche 454測序平臺，在腸道微生物群落多樣性研究方面積累了大量的成功案例。

 美吉生物研究人員通過大量相關文獻的閱讀，發現高通量測序技術在腸道菌群多樣性研究中的應用主要聚焦于以下幾個方面：① 飲食、能量攝取、肥胖與腸道菌群之間的關系；② 腸道菌群與疾病發生之間的關聯；③ 抗生素治療對腸道菌群的影響；④ 不同個體腸道微生物群落結構及其受其他外界因素（壓力、致病菌感染、手術）的影響等。下文對其中的一些文章進行了介紹：

一、飲食、能量攝取、肥胖與腸道菌群之間的關系

1. A core gut microbiome in obese and lean twins--2009《Nature》

Turnbaugh PJ等人對胖瘦不同的同卵雙胞胎（31對）、異卵雙胞胎（23對）及其母親（46個）共154個個體的腸道微生物進行了研究。采用454高通量測序平臺測定了這些個體中微生物16S rRNA基因的V2和V6區，并選取了18個個體，測定了其腸道微生物群落的DNA。結果表明肥胖與腸道門級微生物的變化相關，胖人與瘦人相比，微生物多樣性明顯降低，擬桿菌門（Bacteroidetes）所占比例較低而放線菌門（Actinobacteria）所占比例較高。Shotgun reads與多個數據進行比對，發現不同個體中含有大量共有的微生物基因，在基因水平上可將它們定義為“核心微生物組”，而個體中的微生物與核心微生物組的偏離，則與各種不同的生理狀態相關（如胖瘦）。

2. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa--2010《PNAS》

為了研究飲食對腸道微生物群落多樣性的影響，Filippo CD等人采用454高通量測序技術比較了15個健康歐洲孩子（EU）及14個健康非洲農村孩子（BF）腸道微生物群落的組成。EU的飲食具有典型的西方特色，而BF的食物則能代表傳統的非洲鄉下的飲食構成。研究人員通過PCR擴增29個糞便樣品的16S rRNA基因V5-V6區DNA片段并進行高通量測序，共獲得了438,219條高質量的reads。RDP數據庫比對結果顯示94.2%的reads屬于放線菌門（Actinobacteria），擬桿菌門（Bacteroidetes），壁厚菌門（Firmicutes）和變形桿菌門（Proteobacteria），然而它們在EU和BF中的比例具有顯著差異。BF腸道中擬桿菌占大部分，而壁厚菌所占比例較低。有趣的是，含有大量纖維素和木聚糖水解基因的Prevotella和Xylanibacter菌株只存在于BF中，并且所占比例較高。

二、腸道菌群與疾病發生之間的關聯

1. Gut Microbiota in Human Adults with Type 2 Diabetes Differs from Non-Diabetic Adults--2010《PLoS One》

以往文獻報道腸道菌群與人類代謝疾病之間存在著某種關聯，為了研究糖尿病與腸道微生物的關系，Nadja Larsen等人以18個II型糖尿病男性患者及18個正常男性為研究對象，采用454高通量測序技術對其糞便中微生物16S rRNA基因的V4區進行了測序。序列分析結果發現這些序列分屬于五個門的微生物，包括壁厚菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形桿菌門（phyla Proteobacteria）, 放線菌門（phyla Actinobacteria）和疣微菌門（phyla Verrumicrobia），其中壁厚菌門和擬桿菌門所占比例高達90%以上。糖尿病患者的腸道菌群中壁厚菌門和梭菌綱（Clostridia）的含量明顯低于正常人。另外，擬桿菌門/壁厚菌門以及Bacteroidetes-Prevotella/ C. coccoides- E. rectale的比例與血糖濃度成正相關，但是與身體指數卻不相關。β變形桿菌（Betaproteobacteria）在糖尿病患者中也大量富集現象，并且這類細菌與血糖濃度也成正相關。以上結果揭示人類II型糖尿病的病因與腸道微生物群落組成變化有聯系。

2. Towards the human colorectal cancer microbiome--2011《PLoS One》

Marchesi JR等人采用454高通量測序技術比較了結腸腫瘤和正常結腸粘膜微生物組成的區別。測序樣品來自6個接受了切除術的結腸癌早期患者，選擇的測序區域為16S rRNA基因的V1-V3區。將獲得的測序序列與Sliva和RPD數據庫進行比對分析，發現兩個不同位點的微生物定植模式具有驚人的差異。雖然結腸癌患者個體之間存在一定的差異，腸道腫瘤組織總是為Coriobacteria和一些有益菌形成微生態環境，而潛在的致病性腸桿菌（Enterobacteria）在這些部位卻不具有代表性。研究還發現結腸癌相關的生理和代謝改變招來了覓食腫瘤的共生細菌，它們具有很強的競爭優勢，可能取代了致病菌而牽涉到結腸癌的病因中。

三、抗生素治療對腸道菌群的影響

1. Vancomycin-resistant Enterococcus domination of intestinal microbiota is enabled by antibiotic treatment in mice and precedes bloodstream invasion in humans--2010《J Clin Invest》

耐萬古霉素腸球菌（VRE）等高度耐藥性細菌感染引起的血液病是一個日益嚴重的臨床難題，而準確診斷高危病人是否患有細菌性敗血癥仍極富挑戰。最近的研究表明抗生素能夠改變腸道微生物的多樣性。為了對抗生素的影響情況進行分析，Carles Ubeda等人以感染了VRE的小鼠為研究材料，采用454高通量測序技術對其回腸樣品的16S rRNA基因的V2區進行了測序。研究結果顯示對小鼠進行抗生素治療會導致外源VRE幾乎完全取代小腸和大腸的正常菌群。在臨床上，研究人員也發現接受造血干細胞移植的患者在血液感染之前，使用抗生素治療會導致VRE“稱霸”腸道菌群。抗生素能擾亂正常的共生腸道菌群，并為醫院中的感染性病菌“統治”腸道菌群提供機會。因此，通過高通量DNA測序分析腸道微生物多樣性為診斷高危病人是否患有細菌性敗血癥提供了有效的手段。

2. The Pervasive Effects of an Antibiotic on the Human Gut Microbiota, as Revealed by Deep 16S rRNA Sequencing--2008《PLoS Biology》

來自斯坦福大學的研究人員采用454高通量測序技術探索了抗生素對人類腸道微生物群落組成的影響。他們測定了3個人在服用環丙沙星前后腸道微生物16S rRNA基因的V6和V3區的序列。將獲得的序列與Silva和RPD數據進行比對，共鑒定得到了3,300～5,700個分類單元。研究發現服用抗生素環丙沙星會降低人體腸道微生物的豐富度、多樣性及均勻度，受影響的細菌類群約達三分之一，但是這種影響程度存在顯著的個體差異。另外，研究人員還指出，4個星期后腸道菌群基本已經恢復到用藥前的狀態，但有些細菌在6個月后仍沒有恢復。

四、不同個體腸道微生物群落結構及其受外界因素（壓力、致病菌感染、手術）的影響

1. Composition, variability, and temporal stability of the intestinal microbiota of the elderly--2011《PNAS》

人體腸道微生物群落結構在嬰幼兒、成年人和老年人這三類人群中具有顯著的差異，這表明隨著年齡的增長，腸道菌群也歷經了巨大的變化。Claesson MJ等人收集了161位65歲以上老人及9位成年人腸道菌群的樣品，采用454焦磷酸測序技術測定了16S rRNA基因的V4區序列，每個個體產出超過40,000條reads。研究發現68%的個體腸道中最優勢菌群為擬桿菌門（Bacteroidetes），平均比例約為57%，壁厚菌門（Firmicutes）所占比例約為40%。但是和一些疾病或健康相關的菌群在不同個體中所占比例差別極大，包括變形桿菌門（Proteobacteria）,放線菌門（Actinobacteria）和Faecalibacteria。老年人的核心微生物組與年青人也有鮮明差異，前者擬桿菌屬所占比例更大，梭菌屬在兩者之間具有不同的豐度模式。分析26組time-0和time-3 month糞便樣品，發現85%的個體在這兩個時間的微生物組成極其相近，這表明老年人的腸道菌群呈現出時間穩定性。

2、Stressor exposure disrupts commensal microbial populations in the intestines and leads to increased colonization by Citrobacter rodentium--2010《IAI》

Bailey等人以小鼠為研究對象，探索了壓力對腸道微生物群落多樣性及腸道病原菌易感性的影響。采用454高通量測序技術測定了小鼠腸道微生物16S rRNA基因的V4區，將獲得的數據與RPD進行比對分析，發現長期處在壓力下會導致小鼠腸道厭氧微生物的增多，同時使微生物豐富度及多樣性降低。其中，紫單胞菌科（Porphyromonadaceae），特別是福賽斯坦納菌屬（Tannerella）的細菌相對豐度會降低。以鼠類檸檬酸桿菌（Citrobacter rodentium）感染小鼠，研究結果顯示，長期處在壓力下的小鼠比正常處理的小鼠更易于鼠類檸檬酸桿菌的定植。