葉綠素理化性質的測定

一、原理

葉綠素是一種二羧酸—葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的復雜酯，故可與堿起皂化反應而生成醇（甲醇和葉綠醇）和葉綠酸的鹽，產生的鹽能溶于水中，可用此法將葉綠素與類胡蘿卜素分開；葉綠素與類胡蘿卜素都具有光學活性，表現出一定的吸收光譜，可用分光鏡檢查或用分光光度計精確測定；葉綠素吸收光量子而轉變成激發態，激發態的葉綠素分子很不穩定，當它變回到基態時可發射出紅光量子，因而產生熒光。

葉綠素的化學性質很不穩定，容易受強光的破壞，特別是當葉綠素與蛋白質分離以后，破壞更快，而類胡蘿卜素則較穩定。葉綠素中的鎂可以被H+所取代而成褐色的去鎂葉綠素，后者遇銅則成為綠色的銅代葉綠素，銅代葉綠素很穩定，在光下不易破壞，故常用此法制作綠色多汁植物的浸漬標本。

皂化反應式如下：

二、儀器與用具

20ml刻度試管；10ml小試管；試管架；分光鏡；石棉網；藥匙；燒杯（100ml）；酒精燈；玻棒；鐵三角架；刻度吸量管2ml、5ml各1支；火柴。

三、試劑

1. 95%乙醇；苯；醋酸銅粉末；5%的稀鹽酸；

2. 醋酸-醋酸銅溶液：6g醋酸酮溶于100ml 50%的醋酸中，再加蒸餾水4倍稀釋而成；

3. KOH-甲醇溶液：20g KOH溶于100ml甲醇中，過濾后盛于塞有橡皮塞的試劑瓶中。

四、方法

用葉綠體色素乙醇溶液和水研磨勻漿，進行以下實驗。

1. 光對葉綠素的破壞作用

（1）取4支小試管，其中兩支各加入5ml用水研磨的葉片勻漿，另外兩支各加入2.5ml葉綠體色素乙醇提取液，并用95%乙醇稀釋1倍。

（2）取1支裝有葉綠素乙醇提取液的試管和1支裝有水研磨葉片均漿的試管，放在直射光下，另外兩支放到暗處，40min后對比觀察顏色有何變化，解釋其原因。

2. 熒光現象的觀察

取1支20ml刻度試管加入5ml濃的葉綠體色素乙醇提取液，在直射光下觀察溶液的透射光與反射光顏色有何不同？解釋原因。

3. 皂化作用（綠色素與黃色素的分離）

（1）在做過熒光現象觀察的葉綠體色素乙醇提取液試管中加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液，充分搖勻。

（2）片刻后，加入5ml苯，搖勻，再沿試管壁慢慢加入1~1.5ml蒸餾水，輕輕混勻（勿激烈搖蕩），于試管架上靜置分層。若溶液不分層，則用滴管吸取蒸餾水，沿管壁滴加，邊滴加邊搖動，直到溶液開始分層時，靜置。可以看到溶液逐漸分為兩層，下層是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的葉綠素a和b（以及少量的葉黃素）；上層是苯溶液，其中溶有黃色的胡蘿卜素和葉黃素。

4. 吸收光譜的觀察

將上述已分層的試管溶液，用分光鏡觀察兩類色素的吸收光譜，首先讓下層綠色素部分對準進光孔，看光譜有何變化；然后再將上層黃色素溶液對準進光孔，看光譜又有何變化。把觀察的結果用簡單的圖表示出來。

5. H⁺和Cu²⁺對葉綠素分子中Mg²⁺的取代作用

方法一：

（1）取兩支試管，第一支試管加葉綠體色素提取液2ml，作為對照。第二支試管中加葉綠體色素提取液5ml，再加入5%HCl數滴，搖勻，觀察溶液顏色變化。

（2）當溶液變褐后，再加入少量醋酸銅粉末，微微加熱，觀察記載溶液顏色變化情況，并與對照試管相比較。解釋其顏色變化原因。

方法二：

另取醋酸-醋酸銅溶液20ml，以燒杯盛之。取新鮮植物葉片兩片，放入燒杯中，用酒精燈慢慢加熱，隨時觀察并記錄葉片顏色的變化，直至顏色不再變化為止。解釋原因。

五、注意事項

1.在低溫下發生皂化反應的葉綠體色素溶液，易乳化而出現白絮狀物，溶液渾濁，且不分層。可激烈搖勻，放在30~40℃的水浴中加熱，溶液很快分層，絮狀物消失，溶液變得清澈透明。

2.分離色素用的圓形濾紙，在中心打的小圓孔，周圍必須整齊，否則分離的色素不是一個同心圓。