流式細胞術之染料選擇那些事兒

很多朋友面對各種各樣顏色的流式抗體，在選擇及搭配上就犯了難，在此我們需要了解下流式細胞儀的各個激發光及各個接收通道是如何工作的、常見的熒光素有哪些、這些熒光的特性是什么樣的。了解了這些，選擇抗體和搭配不同的顏色就變得非常簡單了。

我們再回過頭來看看流式細胞儀的原理，熟悉一下流式細胞儀的光路系統。

從這張圖中我們可以看到，激光照射細胞后會產生很多波長的信號，不同的透鏡和濾光片將不同的熒光素的熒光信號區分開，由不同的通道進行接收。光信號通過光電倍增管轉化為電信號，不同強弱的信號反應了細胞不同的物理或者化學性質。

不同型號的流式細胞儀所配備的激光數目和接收通道可能是不同的，常見的是488激光器、此外還有紫外激光器、紫激光器以及紅激光器。通道的順序一般為488激光器先排序，紫外或紫激光器次之，紅激光器最后。來源于同一個激光器的信號，原則上按波長從短到長進行排序，當然也可以自定義通道順序。通道既可以以數字命名也可以以主要的熒光素進行命名。

目前市場上用得最多三種激光主要是488nm、405nm、633nm。我們來看一下某流式細胞儀的通道排序和每個通道接收的熒光的納米范圍。

從這個表中我們可以看到該流式細胞儀屬于3個激光，9個接收通道的類型。每個接收通道有一定的范圍，530/40nm的意思是指該通道能接收510nm~550nm波長的熒光。請注意不要誤解成了可以接收490nm~570nm。我們還可以看到，每個通道有個代表性的熒光素，那么是不是這個通道只能用這一種熒光素呢，答案是否定的。了解了流式細胞儀接收通道的特性，我們還需要了解下熒光素的特性。

流式細胞術發展至今，已有多種熒光素被用于流式分析，我們來看一下常見的熒光素有哪些。

注：熒光素的激發波長是指最適合激發波長，流失細胞儀不一定配備該波長的激光，可選擇相近波長的激光進行激發。熒光素的發射波長是一個區間，不是一個點。上表指的發射波長是指該熒光素的最強發射波長。

除了上表的常見熒光素，目前還有Alex Fluor系列，該系列熒光素比一般的熒光素信號更強，光穩定性更好，并且很多可以代替上表中的傳統熒光素，選擇和搭配的原理和普通熒光素是一致的。了解了不同熒光素的激發波長及發射波長之后，我們把它對應到流式細胞儀的激光器和接收通道上，就知道該如何選擇熒光素了。

在搭配之前，我們需要明白的一點，就是不同激光器對應的通道，在物理上是分隔的，比如PE-Cy5和APC，這兩個熒光素的接收波長是重疊的，但前者的激光器是488nm，后者是633nm，因而這兩個熒光素可以同時使用互不干擾。在搭配抗體之前，首先應該了解所需要使用的流式細胞儀有哪幾個激光，選擇不同激光器激發的抗體是最保守并且不會錯的，比如pacific Blue（405激光器）、PE（488激光器）、APC（633激光器）這三個一起用基本不會出錯。如果需要更多的顏色，需要使用同一個激光器激發的時候，關注下熒光素的發射波長，差異越大越好。看到這，是不是覺得流式抗體的選擇非常簡單了？