分子生物學常用實驗技術（page3)

分子雜交技術

　　 互補的核苷酸序列通過Walson-Crick 堿基配對形成穩定的雜合雙鏈分子DNA 分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的,可以根據所使用的探針已知序列進行特異性的靶序列檢測。雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA,也可以是細胞總DNA 或總RNA。根據使用的方法被檢測的核酸可以是提純的，也可以在細胞內雜交, 即細胞原位雜交。探針必須經標記，以便示蹤和檢測。使用最普遍的探針標記物是同位素, 但由于同位素的安全性，近年來發展了許多非同位素標記探針的方法。核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特異性,因而該技術在分子生物學領域中已廣泛地使用于克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列的定性、定量檢測和疾病的診斷等方面。因而它不僅在分子生物學領域中具有廣泛地應用,而且在臨床診斷上的應用也日趨增多。

第一節核酸探針標記的方法

　　核酸探針根據核酸的性質，可分為DNA 和RNA 探針;根據是否使用放射性標記物的與否,可分為放射性標記探針和非放射性標記探針;根據是否存在互補鏈,可分為單鏈和雙鏈探針;根據放射性標記物摻入情況,可分為均勻標記和末端標記探針。下面將介紹各種類型的探針及標記方法。

一、雙鏈DNA 探針及其標記方法

　　分子生物研究中，最常用的探針即為雙鏈DNA 探針，它廣泛應用于基因的鑒定、臨床診斷等方面。雙鏈DNA 探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機引物合成法。

1. 切口平移法(nick translation) 當雙鏈DNA 分子的一條鏈上產生切口時,E.coli DNA 聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3'羥基末端。同時該酶具有從5'→3'的核酸外切酶活性,能從切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3'端補上核苷酸,從而使切口沿著DNA 鏈移動,用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素摻入到合成新鏈中。最合適的切口平移片段一般為50-500 個核苷酸。切口平移反應受幾種因素的影響: 產物的比活性取決于[α-32 P]dNTP 的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。DNA 酶Ⅰ的用量和E.coli DNA 聚合酶的質量會影響產物片段的大小。DNA 模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性, 故應使用仔細純化后的DNA。
材料： 待標記的DNA。
設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
試劑：
(1)10×切口平移緩沖液:0.5mol/L Tris?Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mmol/L DTT; 100μg/ml
BSA。
(2)未標記的dNTP 原液:除同位素標記的脫氧三磷酸核苷酸外,其余3 種分別溶解于50mmol/L
Tris?Cl (pH7.5)溶液中,濃度為0.3mmol/L。
(3)[α-32 P] dCTP 或[α-32 P]dATP:400 Ci/mmol, 10μCi/μl。
(4) E.coli DNA 聚合酶Ⅰ(4 單位/μ l):溶于50μ g/ml BSA, 1mmol/L DTT, 50%甘油，50mmol/L
Tris?Cl(pH7.5)中。
(5)DNA 酶Ⅰ:1mg/ml。
EDTA :200mmol/L (pH8.0)。
(7)10mol/L NH4Ac。
操作步驟:
(1) 按下列配比混合:
未標記的dNTP 10μl
10×切口平移緩沖液5μl
待標記的DNA 1μg
[α-32 P]dCTP 或dATP(70μCi) 7μl
E.coli DNA 聚合酶4 單位
DAN 酶I 1μl
加水至終體積50μl
(2) 置于15℃水浴60 分鐘。
(3) 加入5μl EDTA 終止反應。
(4) 反應液中加入醋酸銨,使終濃度為0.5mol/L, 加入兩倍體積預冷無水乙醇沉淀回收DNA探針。
[注意] 1、3H，32P 及35S 標記的dNTP 都可使用于探針標記，但通常使用[α-32 P]-dNTP。
2、DNA 酶Ⅰ的活性不同，所得到的探針比活性也不同，DNA 酶Ⅰ活性高，則所得探針比活性高，但長度比較短。
2. 隨機引物合成法隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA 模板結合,在Klenow 酶的作用下,合成DNA 探針。合成產物的大小、產量、比活性依賴于反應中模板、引物、dNTP 和酶的量。通常,產物平均長度為400-600 個核苷酸。利用隨機引物進行反應的優點是：(1)Klenow 片段沒有5'→3'外切酶活性,反應穩定,可以獲得大量的有效探針。(2)反應時對模板的要求不嚴格,用微量制備的質粒DNA 模板也可進行反應。(3)反應產物的比活性較高,可達4×109 cpm/μg 探針。(4)隨機引物反應還可以在低熔點瓊脂糖中直接進行。
材料：待標記的DNA 片段。
設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
試劑：
(1)隨機引物（隨機六聚體或斷裂的鮭魚精子DNA）。
(2)10×隨機標記緩沖液：900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。
(3)Klenow 片段。
(4)20mmol/L DTT。
(5)未標記的dNTP 溶液：dGTP、dCTP 和dTTP 溶液，各5mmol/L。
[α-32 P] dATP：比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。
(7)緩沖液A：50mmol/L Tris?Cl （pH7.5）; 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA （pH8.0）; 0.5%
SDS。
操作步驟:
(1) 200ng 雙鏈DNA(1μl)和7.5ng 隨機引物(1μl)混合后置于eppendorf 管內,水浴煮沸5 分鐘后，立即置于冰浴中1 分鐘。
(2) 與此同時,盡快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf 管內混合下列化合物:
20mmol/L DTT 1μl
未標記的dNTP 溶液1μl
10×隨機標記緩沖液1μl
[α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl) 3μl
ddH2O 1μl
(3) 將步驟(1)eppendorf 管中的溶液移到步驟(2)管中。
(4) 加入5 單位(約1μl) Klenow 片段, 充分混合,在微型離心機中以12000g 離心1-2 秒, 使所有溶液沉于試管底部,在室溫下保溫3-16 小時。
(5) 在反應液中加入10μl 緩沖液A 后,將放射性標記的探針保存在-20℃下備用。同時計算放射比活性。
[注意]1、引物與模板的比例應仔細調整，當引物高于模板時，反應產物比較短，但產物的累積較多；反之，則可獲得較長片段的探針。
2、模板DNA 應是線性的，如為超螺旋DNA，則標記效率不足50%。

二、單鏈DNA 探針

　　用雙鏈探針雜交檢測另一個遠緣DNA 時,探針序列與被檢測序列間有很多錯配。而兩條探針互補鏈之間的配對卻十分穩定,即形成自身的無效雜交,結果使檢測效率下降。采用單鏈探針則可解決這一問題。單鏈DNA 探針的合成方法主要有下列兩種1) 以M13 載體衍生序列為模板,用Klenow 片段合成單鏈探針; (2) 以RNA 為模板, 用反轉錄酶合成單鏈cDNA 探針。

1. 從M13 載體衍生序列合成單鏈DNA 探針合成單鏈DNA 探針可將模板序列克隆到噬粒或M13噬菌體載體中,以此為模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸為引物, 在[a-32P]-dNTP 的存在下,由Klenow 片段作用合成放射標記探針，反應完畢后得到部分雙鏈分子。在克隆序列內或下游用限制性內切酶切割這些長短不一的產物,然后通過變性凝膠電泳(如變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)將探針與模板分離開。雙鏈RF 型M13 DNA 也可用于單鏈DNA 的制備,選用適當的引物即可制備正鏈或負鏈單鏈探針。
材料：已制備好的單鏈DNA 模板（方法參見第十章中有關內容）。
設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
試劑：
(1)10×Klenow 緩沖液：0.5mol/L NaCl, 0.1mol/L Tris?Cl(pH7.5); 0.1mol/L MgCl2。
(2)0.1mol/L DTT 溶液。
(3) [α-32 P] dATP：3000Ci/mmol, 10μCi/μl。
(4)40mmol/L 和20mmol/L 的未標記的dNTP 溶液。
(5)dCTP,dTTP,dGTP 各20mmol/L 的溶液。
Klenow 片段（5 單位/ml）。
(7)適宜的限制酶，如EcoRⅠ、HindⅢ等。
0.5mol/L EDTA （pH8.0）。
操作步驟：
(1)在0.5ml eppendorf 管中混合如下溶液：
單鏈模板（約0.5pmol） 1mg
適當引物5pmol
10×Klenow 緩沖液3ml
加水至20ml
(2)將eppendorf 管加熱到85℃ 5 分鐘，在30 分鐘內，使小離心管降到37℃；
(3)依次加入：
DTT 2ml
[a-32P]dATP 5ml
未標記的dATP 1ml
dGTP,dCTP,dTTP 混合液1ml
混合均勻后，稍離心使之沉于試管底部。
(4)加1ml（5 單位）Klenow 酶室溫下30 分鐘。
(5)加1ml20mmol/L 未標記的dATP 溶液20 分鐘。68℃加熱10 分鐘，使Klenow 片段失活。調整NaCl 濃度，使之適宜于酶切。
(7)加入20 單位限制性內切酶（如EcoRⅠ, HindⅢ等）酶切1 小時。酚/氯仿抽提DNA，乙醇沉淀以去除dNTP 或加0.5mol/LEDTA(pH8.0)至終濃度10mmol/L。
(9)用電泳方法分離放射性標記的探針。

2. 從RNA 合成單鏈cDNA 探針cDNA 單鏈探針主要用來分離cDNA 文庫中相應的基因。用RNA為模板合成cDNA 探針所用的引物有兩種: (1)用寡聚dT 為引物合成cDNA 探針。本方法只能用于帶Poly(A)的mRNA,并且產生的探針極大多數偏向于mRNA 3'末端序列。(2) 可用隨機引物合成cDNA探針。該法可避免上述缺點,產生比活性較高的探針。但由于模板RNA 中通常含有多種不同的RNA 分子,所得探針的序列往往比以克隆DNA 為模板所得的探針復雜得多, 應預先盡量富集mRNA 中的目的序列。反轉錄得到的產物RNA/DNA 雜交雙鏈經堿變性后,RNA 單鏈可被迅速地降解成小片段,經Sephadex G-50 柱層析即可得到單鏈探針。
材料：已提純的RNA 或mRNA
設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。
試劑：
(1)合適的引物：隨機引物或oligo(dT)15-18。
(2)5mmol/L dGTP, dATP dCTP, dTTP。
(3) [a-32P]dCTP(>3000Ci/mmol, 10mCi/ml)。
(4)反轉錄酶(200000 單位/ml)。
(5)100mmol/L DTT。
250mmol/L MgCl2。
(7)1mol/L KCl。
0.5mol/L EDTA (pH8.0)。
(9)10% SDS。
(10)RNasin(40 單位/ml)。
操作步驟:
(1)在已置于冰浴中的滅菌離心管中加入下列試劑：
RNA 或mRNA 10.0ml
合適的產物(1mg/ml) 10.0ml
1mol/L Tris?Cl(pH7.6) 2.5ml
1mol/L KCl 3.5ml
250mmol/L MgCl2 2.0ml
5mmol/L dNTP 10.0ml
[a-32P]dCTP 10.0ml
0.1mol/L DTT 2.0ml
Rnasin 20U
加水至48ml
反轉錄酶(200000 單位/ml) 2ml
混勻后,稍稍離心，37℃保溫2 小時。
(2) 反應完畢后加入下列試劑： 0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2ml 10% SDS 2ml
(3) 加入3ml 3mol/L NaOH。68℃保溫30 分鐘以水解RNA。
(4) 冷卻至室溫后, 加入10ml 1mol/L Tris?Cl (pH7.4)。混勻。然后加入3ml 2mol/L HCl。
(5) 酚/氯仿抽提后，用Sephadex G-50 柱層析或乙醇沉淀法分離標記的探針。[注意] RNA 極易降解，因而實驗中的所有試劑和器皿均應在DEPC 處理后，滅菌備用。

三、末端標記DNA 探針
現以Klenow 片段標記3'末端為例說明末端標記的方法。
1、材料：待標記的雙鏈含凹缺3'末端的DNA。
2、設備：高速臺式離心機，水浴鍋等。
3、試劑：
(1)3 種不含標記的dNTP 各為200mmol/L。
(2)合適的限制酶。
(3)[α-32P] dNTP:3000Ci/mmol, 10mCi/ul。
(4)Klenow 片段(5U/ml)。
(5)10×末端標記緩沖液:0.5mol/L Tris?Cl (pH7.2), 0.1mol/L MgSO4, 1mmol/L DTT, 500mg/mlBSA。
4、操作步驟：
(1)25μl 反應體系中用合適的限制酶酶切1μg 的DNA。
(2)按下列成分加入試劑并混勻： 已酶切的DNA 1mg (25ml) 10×末端標記緩沖液5ml 2mmol/L3 種dNTP 1ml [a-32P]-dNTP 適量加水至50ml
(3)加入1 單位的Klenow 片段,室溫下反應30 分鐘。
(4)加入1ml 2mmol/L 第四種核苷酸溶液, 室溫保溫15 分鐘。
(5)70℃加熱5 分鐘,終止反應。
用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉淀來分離標記的DNA,或用Sephdadex G-50 柱層析分離標記的DNA。
[注意]
1、利用本方法可對DNA 分子量標準進行標記，利用它可定位因片段太小而無法在凝膠中觀察的DNA 片段。
2、對DNA 的純度不很嚴格，少量制備的質粒也可進行末端標記合成探針。
3、末端標記還有其他的一些方法，如利用T4 多核苷酸激酶標記脫磷的5'端突出的DNA 和平末端凹缺DNA 分子，也可利用該酶進行交換反應標記5'末端。

四、寡核苷酸探針
　　利用寡核苷酸探針可檢測到靶基因上單個核苷酸的點突變。常用的寡核苷酸探針主要有兩種:單一已知序列的寡核苷酸探針和許多簡并性寡核苷酸探針組成的寡核苷酸探針庫。單一已知序列寡核苷酸探針能與它們的目的序列準確配對,可以準確地設計雜交條件,以保證探針只與目的序列雜交而不與序列相近的非完全配對序列雜交,對于一些未知序列的目的片段則無效。
1、材料：待標記的寡核苷酸(10pmol/μl)。
2、設備：高速離式離心機，恒溫水浴鍋等。
3、試劑：
(1)10×T4 多核苷酸激酶緩沖液:0.5mol/L Tris?Cl (pH7.6), 0.1mol/L MgCl2 , 50mmol/L DTT,
1mmol/L Spermidine?HCl, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。
(2)[γ-32 P] ATP(比活性7000Ci/mmol; 10mCi/ml)。
(3)T4 多核苷酸激酶（10 單位/ml）。
4、操作步驟：
(1)100ng 寡核苷酸溶于30ml 水中。置65℃變性5 分鐘，迅速置冰溶中。
(2)立即加入下列試劑：
10×激酶緩沖液5ml
[g-32P]ATP(比活性7000Ci/mmol;10mCi/ml) 10ml
T4 多核苷酸激酶2ml
加水至50ml
混勻后置37℃水浴20 分鐘。
(3)再加入20 單位T4 多核苷酸激酶，置37℃水浴20 分鐘后立即置冰浴中。
(4)Sephadex G-50 柱層析。

　　此方法是在每個探針的5'末端多加了一個磷酸，理論上，這會影響其與DNA 的雜交。因此，建議使用Klenow DNA 聚合酶的鏈延伸法獲得高放射性的寡核苷酸探針。除了常見的同位素標記探針外，還有利用非同位素標記探針和雜交的方法，許多公司都有不同的非同位素標記探針的雜交系統出售，可根據這些公司所提供的操作步驟進行探針的標記和雜交。

五、RNA 探針
　　許多載體如pBluescript, pGEM 等均帶有來自噬菌體SP6 或E.coli 噬菌體T7 或T3 的啟動子,它們能特異性地被各自噬菌體編碼的依賴于DNA 的RNA 聚合酶所識別,合成特異性的RNA。在反應體系中若加入經標記的NTP，則可合成RNA 探針。RNA 探針一般都是單鏈,它具有單鏈DNA 探針的優點,又具有許多DNA 單鏈探針所沒有的優點，主要是： RNA NA 雜交體比DNA NA 雜交體有更高的穩定性,所以在雜交應中RNA 探針比相同比活性的DNA 探針所產生信號要強。RNA:RNA 雜交體用RNA 酶A 酶切比S1 酶切DNA:RNA 雜交體容易控制,所以用RNA 探針進行RNA 結構分析比用DNA 探針效果好。噬菌體依賴DNA 的RNA 聚合酶所需的rNTP 濃度比Klenow 片段所需的dNTP 濃度低,因而能在
較低濃度放射性底物的存在下,合成高比活性的全長探針。用來合成RNA 的模板能轉錄許多次,所以RNA 的產量比單鏈DNA 高。并且用來合成RNA 的模板能轉錄多次，可獲得比單鏈DNA 更高產量的RNA。

　　反應完畢后，用無RNA 酶的DNA 酶Ⅰ處理,即可除去模板DNA,而單鏈DNA 探針則需通過凝膠電泳純化才能與模板DNA 分離。另外噬菌體依賴于DNA 的RNA 聚合酶不識別克隆DNA 序列中的細菌、質粒或真核生物的啟動子，對模板的要求也不高,故在異常位點起始RNA 合成的比率很低。因此,當將線性質粒和相應的依賴DNA 的RNA 聚合酶及四種rNTP 一起保溫時,所有RNA 的合成,都由這些噬菌體啟動子起始。而在單鏈DNA 探針合成中,若模板中混雜其他DNA 片段,則會產生干擾。但它也存在著不可避免的缺點，因為合成的探針是RNA，它對RNase 特別敏感，應而所用的器皿試劑等均應仔細地去除RNase；另外如果載體沒有很好地酶切則等量的超螺旋DNA 會合成極長的RNA，它有可能帶上質粒的序列而降低特異性。

第二節幾種常見的雜交
　　分子雜交是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標記的探針與被固定的分子雜交，經顯影后顯示出目的DNA 或RNA 分子所處的位置。根據被測定的對象，分子雜交基本可分為以下幾大類：
(1) Southern 雜交NA 片段經電泳分離后,從凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上,然后與探針雜交。被檢對象為DNA,探針為DNA 或RNA。
(2) Northern 雜交:RNA 片段經電泳后,從凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜上,然后用探針雜交。被檢對象為RNA,探針為DNA 或RNA。根據雜交所用的方法,另外還有斑點(dot)雜交、狹槽(slot)雜交和菌落原位雜交等。有3 種固相支持體可用于雜交:硝酸纖維素濾膜、尼龍膜和Whatman 541 濾紙。不同商標的尼龍膜需要進行不同的處理，在DNA 固定和雜交的過程中要嚴格按生產廠家的說明書來進行。Whatman 541 濾紙有很高的濕強度,最早用于篩選細菌菌落。該濾紙主要用于篩選一些基因文庫。固定化DNA 的雜交條件基本與使用硝酸纖維素濾膜時所建立的條件相同。Whatman 541 濾紙與硝酸纖維素濾膜相比有一些優點:它更便宜,雜交中更耐用,干燥過程中不易變形和碎裂等。然而若變性過程不小心,雜交信號的強度會明顯弱于用硝酸纖維素濾膜時所得到的信號強度。因此,常規的細菌篩選和各種雜交時仍選用硝酸纖維素濾膜作為固相支持體。

一、Southern 雜交
　　Southern 雜交可用來檢測經限制性內切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列,它包括下列步驟:
(1) 酶切DNA, 凝膠電泳分離各酶切片段,然后使DNA 原位變性。
(2) 將DNA 片段轉移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。
(3) 預雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點。
(4) 讓探針與同源DNA 片段雜交,然后漂洗除去非特異性結合的探針。
(5) 通過顯影檢查目的DNA 所在的位置。
　　 Southern 雜交能否檢出雜交信號取決于很多因素,包括目的DNA 在總DNA 中所占的比例、探針的大小和比活性、轉移到濾膜上的DNA 量以及探針與目的DNA 間的配對情況等。在最佳條件下,放射自顯影曝光數天后, Southern 雜交能很靈敏地檢測出低于0.1pg 與32 P 標記的高比活性探針的(>109cpm/μg)互補DNA。如果將10μg 基因組DNA 轉移到濾膜上，并與長度為幾百個核苷酸的探針雜交,曝光過夜,則可檢測出哺乳動物基因組中1kb 大小的單拷貝序列。將DNA 從凝膠中轉移到固體支持物上的方法主要有3 種1)毛細管轉移。本方法由Southern 發明,故又稱為Southern 轉移(或印跡)。毛細管轉移方法的優點是簡單,不需要用其他儀器。缺點是轉移時間較長,轉移后雜交信號較弱。(2)電泳轉移。將DNA 變性后,可電泳轉移至帶電荷的尼龍膜上。該法的優點是不需要脫嘌呤/水解作用,可直接轉移較大的DNA 片段。缺點是轉移中電流較大,溫度難以控制。通常只有當毛細管轉移和真空轉移無效時,才采用電泳轉移。(3) 真空轉移。有多種真空轉移的商品化儀器,它們一般是將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上,再將凝膠置于濾膜上,緩沖液從上面的一個貯液槽中流下,洗脫出凝膠中的DNA,使其沉積在濾膜上。該法的優點是快速,在30 分鐘內就能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度(<1%)的凝膠中量地轉移出來。轉移后得到的雜交信號比Southern 轉移強2-3 倍。缺點是如不小心，會使凝膠碎裂, 并且在洗膜不嚴格時,其背景比毛細轉移要高。

1、材料： 待檢測的DNA，已標記好的探針。
2、設備： 電泳儀，電泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自顯影盒，X-光片，雜交袋，硝酸纖維素濾膜或尼龍膜，濾紙。
3、試劑：
(1)10mg/ml 溴化乙錠（EB）。
(2)50×Denhardt's 溶液：5g Ficoll-40, 5g PVP, 5g BSA 加水至500ml,過濾除菌后于-20℃儲存。
(3)1×BLOTTO:5g 脫脂奶粉，0.02%疊氮鈉，儲于4℃。
(4)預雜交溶液:6×SSC, 5×Denhardt, 0.5% SDS, 100mg/ml 鮭魚精子DNA, 50%甲酰胺。
(5)雜交溶液:預雜交溶液中加入變性探針即為雜交溶液。
0.2mol/L HCl。
(7)0.1% SDS。
0.4mol/L NaOH。
(9)變性溶液:87.75g NaCl, 20.0g NaOH 加水至1000ml。
(10)中和溶液:175.5g NaCl, 6.7g Tris?Cl, 加水至1000ml。
(11)硝酸纖維素濾膜。
(12)20×SSC: 3mol/L NaCl, 0.3mol/L 檸檬酸鈉,用1mol/L HCl 調節pH 至7.0;
(13)2×、1×、0.5×、0.25×和0.1×SSC:用20×SSC 稀釋。
4、操作步驟：
(1) 約50μl 體積中酶切10pg-10μg 的DNA, 然后在瓊脂糖凝膠中電泳12-24 小時(包括DNA分子量標準物)。
(2) 500ml 水中加入25μl 10mg/ml 溴化乙錠,將凝膠放置其中染色30 分鐘, 然后照相。
(3) 依次用下列溶液處理凝膠,并輕微搖動: 500ml 0.2mol/L HCl 10 分鐘, 傾去溶液(如果限制性片段>10kb, 酸處理時間為20 分鐘)，用水清洗數次,傾去溶液; 500ml 變性溶液兩次,每次15 分鐘,傾去溶液; 500ml 中和溶液30 分鐘。如果使用尼龍膜雜交，本步可以省略。
(4) 戴上手套,在盤中加20×SSC 液,將硝酸纖維素濾膜先用無菌水完全濕透,再用20×SSC 浸泡。將硝酸纖維素濾膜一次準確地蓋在凝膠上,去除氣泡。用浸過20×SSC 液的3 濾紙蓋住濾膜,然后加上干的3 濾紙和干紙巾,根據DNA 復雜程度轉移2-12 小時。當使用尼龍膜雜交時，該膜用水浸潤一次即可，轉移時用0.4mol/L NaOH 代替20×SSC。簡單的印跡轉移2-3 小時,對于基因組印跡,一般需要較長時間的轉移。
(5) 去除紙巾等,用藍色圓珠筆在濾膜右上角記下轉移日期,做好記號,取出濾膜,在2×SSC 中洗5分鐘,涼干后在80℃中烘烤2 小時。注意在使用尼龍膜雜交時，只能空氣干燥，不得烘烤。將濾膜放入含6-10ml 預雜交液的密封小塑料袋中,將預雜交液加在袋的底部,前后擠壓小袋,使濾膜濕透。在一定溫度下(一般為37-42℃)預雜交3-12 小時，棄去預雜交液。
(7) 制備同位素標記探針（參見第一節），探針煮沸變性5 分鐘。在雜交液中加入探針,混勻。如步驟（6）將混合液注入密封塑料袋中,在與預雜交相同溫度下雜交6-12 小時。
(9) 取出濾膜,依次用下列溶液處理,并輕輕搖動: 在室溫下, 1×SSC/0.1% SDS, 15 分鐘, 兩次。在雜交溫度下, 0.25×SSC/0.1% SDS, 15 分鐘, 兩次。
(10) 空氣干燥硝酸纖維素濾膜,然后在X 光片上曝光。通常曝光1-2 天后可見DNA 譜帶。對于≥108 cpm/μg 從缺口平移所得探針,可很容易地從10μg 哺乳DNA 中檢測到10pg 的單拷貝基因。

二、Northern 雜交
　　Northern 雜交與Southern 雜交很相似。主要區別是被檢測對象為RNA,其電泳在變性條件下進行,以去除RNA 中的二級結構,保證RNA 完全按分子大小分離。變性電泳主要有3 種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。電泳后的瓊脂糖凝膠用與Southern 轉移相同的方法將RNA 轉移到硝酸纖維素濾膜上,然后與探針雜交。
1、材料：待檢測的RNA 及制備好的探針。
2、設備：電泳儀，電泳槽，塑料盆，真空烤箱，放射自顯影盒，X-光片，雜交袋，硝酸纖維素膜或尼龍膜。
3、試劑：
(1)20×SSPE:175.3g NaCl, 88.2g 檸檬酸鈉，溶于800ml 水中，用10mol/LNaOH 調pH 至7.4，定溶到1L。
(2)其他試劑：與Southern 雜交試劑類似，只是所有的試劑均應用DEPC 處理。
4、操作步驟：
(1)RNA 經變性電泳完畢后,可立即將乙醛酰RNA 轉移至硝酸纖維素濾膜上。轉移方法與轉移DNA的方法相似。
(2)轉移完畢后,以6×SSC 溶液于室溫浸泡此膜5 分鐘,以除去瓊脂糖碎片。
(3)將該雜交膜夾于兩張濾紙中間,用真空烤箱于80℃干燥0.5-2 小時。
(4) 用下列兩種溶液之一進行預雜交，時間為1-2 小時。若于42℃進行,應采用: 50%甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt's 試劑，0.1% SDS；若于68℃進行,應采用:6×SSC，2×Denhardt's 試劑，0.1%SDS，（注意：BLOTTO 不能用于Northern 雜交）。
(5) 在預雜交液中加入變性的放射性標記探針,如欲檢測低豐度mRNA,所用探針的量至少為0.1μg,其放射性比活度應大于2×108 cpm/分?μg,放在適宜的溫度條件下雜交16-24 小時。用1×SSC、0.1% SDS 于室溫洗膜20 分鐘,隨后用0.2×SSC、0.1% SDS 于68℃洗膜3 次,每次20 分鐘。
(7) 用X 光片(Kodak XAR-2 或與之相當的產品)進行放射自顯影,附加增感屏于-70℃曝光24-48小時。
[注意]
(1)如果瓊脂糖濃度高于1%，或凝膠厚度大于0.5cm，或待分析的RNA 大于2.5kb,需用0.05mol/LNaOH 浸泡凝膠20 分鐘,部分水解RNA 并提高轉移效率。浸泡后用經DEPC 處理的水淋洗凝膠,并用20×SSC 浸泡凝膠45 分鐘。然后再轉移到濾膜上。
(2)在步驟(3)的操作中，如果濾膜上含有乙醛酰RNA,雜交前需用20mmol/L Tris?Cl (pH8.0)于65℃洗膜,以除去RNA 上的乙二醛分子。
(3)RNA 自凝膠轉移至尼龍膜所用方法，與RNA 轉移至硝酸纖維素濾膜所用方法類似。
(4)含甲醛的凝膠在RNA 轉移前需用經DEPC 處理的水淋洗數次,以除去甲醛。當使用尼龍膜雜交時注意，有些帶正電荷的尼龍膜在堿性溶液中具有固著核酸的能力，需用7.5mmol/LNaOH 溶液洗脫瓊脂糖中的乙醛酰RNA，同時可部分水解RNA，并提高較長RNA 分子(>2.3kb)轉移的速度和效率。
　　 此外，堿可以除去mRNA 分子的乙二醛加合物,免去固定后洗脫的步驟。乙醛酰RNA 在堿性條件下轉移至帶正電荷尼龍膜的操作也按DNA 轉移的方法進行，但轉移緩沖液為7.5mmol/LNaOH，轉移結束后(4.5-6.0 小時)，尼龍膜需用2×SSC、0.1%SDS 淋洗片刻、于室溫晾干。
(5)尼龍膜的不足之處是背景較高,用RNA 探針時尤為嚴重。將濾膜長時間置于高濃度的堿性溶液中,會導致雜交背景明顯升高,可通過提高預雜交和雜交步驟中有關阻斷試劑的量來予以解決。如用中性緩沖液進行RNA 轉移,轉移結束后,將晾干的尼龍膜夾在兩張濾紙中間,80℃干烤0.5-2 小時,或者254nm 波長的紫外線照射尼龍膜帶RNA 的一面。后一種方法較為繁瑣,但卻優先使用,因為某些批號的帶正電荷的尼龍膜經此處理后,雜交信號可以增強。然而為獲得最佳效果,務必確保尼龍膜不被過度照射，適度照射可促進RNA 上小部分堿基與尼龍膜表面帶正電荷的胺基形成交聯結構,而過度照射卻使RNA 上一部分胸腺嘧啶共價結合于尼龍膜表面,導致雜交信號減弱。

三、菌落原位雜交
　　對分散在若干個瓊脂平板上的少數菌落（100-200）進行克隆篩選時，可采用本方法。將這些菌落歸并到一個瓊脂主平板以及已置于第二個瓊脂平板表面的一張硝酸纖維素濾膜上。經培養一段時間后，對菌落進行原位裂解。主平板應貯存于4℃直至得到篩選結果。
1、材料：待檢測的細菌平皿，已標記好的探針，硝酸纖維素濾膜等。
2、設備：恒溫烤箱，恒溫水浴，臺式高速離心機等。
3、試劑：
(1)LB 固體培養基。
(2)0.5mol/L NaOH。
(3)1mol/L Tris?Cl。
(4)1.5mol/L NaCl。
(5)0.5mol/L Tris?Cl。
預洗液：5×SSC, 0.5%SDS, 1mmol/L EDTA (pH8.0)。
(7)預雜交液：50%甲酰胺，6×SSC（或6×SSPE），0.05×BLOTTO(甲酰胺可不用)。其余試劑：與Southern 雜交相同。
4、操作步驟：
1. 將少數菌落轉移到硝酸纖維素濾膜上：
(1) 在含有選擇性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。
(2) 用無菌牙簽將各個菌落先轉移至濾膜上,再轉移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應按一定的格子進行劃線接種(或打點)。每菌落應分別劃線于兩個平板的相同位置上。最后，在濾膜和主平板上同時劃一個含有非重組質粒（如pBR322)的菌落。
(3) 倒置平板,于37℃培養至劃線的細菌菌落生長到0.5-1.0mm 的寬度。
(4) 用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂,在3 個以上的不對稱位置作標記。在主平板大致相同的位置上也作上標記。
(5) 用Parafilm 膜封好主平板,倒置貯放于4℃,直至獲得雜交反應的結果。裂解細菌,按本段下面所述方法,使釋放的DNA 結合于硝酸纖維素濾膜。
2. 菌落的裂解及DNA 結合于硝酸纖維素濾膜
(1) 在一張保鮮膜上制作一個裝有0.5mol/L NaOH 的小洼(0.75ml),使菌落面朝上,將濾膜放到小洼上,展平保鮮膜,使濾膜均勻濕潤,讓濾膜留于原處2-3 分鐘。
(2) 用干紙巾從濾膜的下方吸干濾膜,用一張新的保鮮膜和新配制的0.5mol/L NaOH 重復步驟(1)。
(3) 吸干濾膜,將濾膜轉移到新的帶有1mol/L Tris?Cl(pH7.4)的保鮮膜洼上。5 分鐘后吸干濾膜, 再重復一次該步驟。
(4) 吸干濾膜,把它轉移到有1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris?Cl (pH7.4)的保鮮膜小洼上5 分鐘后吸干濾膜,轉移到一張干的濾紙上,置于室溫20-30 分鐘,使濾膜干燥。
(5) 將濾膜夾在兩張干的濾紙之間,在真空烤箱中于80℃干烤2 小時,固定DNA。將固定在膜上的DNA 與32 P 標記的探針雜交。
５.雜交
(1) 盛有2×SSC 的塑料盤同，將干烤的濾膜飄浮在液面上,徹底浸濕5 分鐘。
(2) 將濾膜轉到200ml 預洗液的玻璃皿中。濾膜何疊在一起,放于溶液中。用保鮮膜蓋住玻璃皿,放到位于培養箱內的旋轉平臺上。于50℃處理30 分鐘。在這一步及以后的所有步驟中,應緩緩搖動濾膜,防止它們粘在一起。
(3) 用泡過預洗液的吸水棉紙輕輕地從膜表面拭去細菌碎片,以降低雜交背景而不影響陽性雜交
信號的強度和清晰度。
(4) 將濾膜轉到盛有150ml 預雜交液的玻璃中,在適宜溫度(即在水溶液中雜交時用68℃，而在
50%甲酰胺中雜交時用42℃)下,預雜交1-2 小時。
(5) 將32 P 標記的雙鏈DNA 探針于100℃加熱5 分鐘,迅速置于冰浴中。單鏈探針不必變性。將探針加到雜交袋中雜交過夜。雜交期間，盛濾膜的容器應蓋嚴，以防液體蒸發。雜交結束后,去除雜交液,立即于室溫把濾膜放入大體積(300-500ml)的2×SSC 和0.1% SDS溶液中,輕輕振搖5 分鐘，并將濾膜至少翻轉一次。重復洗一次，同時應避免膜干涸。
(7)68℃用300-500ml 1×SSC 和0.1% SDS 溶液洗膜兩次,每次1-1.5 小時。此時已可進行放射自顯影。如背景很高或實驗要求嚴格的洗膜條件,可用300-500ml 0.2×SSC 和0.1% SDS 的溶液于68℃將濾膜浸泡60 分鐘。把濾膜放在紙巾上于室溫晾干后,把濾膜(編號面朝上)放在一張保鮮膜上,并在保鮮膜上作幾個不對稱的標記,以使濾膜與放射性自顯影片位置對應。
(9) 用第二張保鮮膜蓋住濾膜。加X 光片并加上增感屏于-70℃曝光12-16 小時。
(10) 底片顯影后,在底片上貼一張透明硬紙片。在紙上標記陽性雜交信號的位置,同時在不對稱分布點的位置上作出標記。可從底片上取下透明紙,通過對比紙上的點與瓊脂上的點來鑒定陽性菌落。

四、斑點雜交
　　斑點雜交是指將DNA 或RNA 樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上,然后與核酸探針分子雜交，以顯示樣品中是否存在特異的DNA 或RNA。同一種樣品經不同倍數的稀釋,還可以得到半定量的結果。所以它是一種簡便、快速、經濟的分析DNA 或RNA 的方法,在基因分析和基因診斷中經常用到,是研究基因表達的有力工具。但由于目的序列未與非目的序列分離,不能了解目的序列的長度。尤其當本底干擾較高時,難以區分目的序列信號和干擾信號。
1、材料：待分析的DNA 或RNA 樣品，已標記的探針。
2、設備：狹槽點樣器，真空泵，恒溫水浴，真空烤箱等。
3、試劑：
（1）100% 甲酰胺。
（2）甲醛(37%)。
（3） 20×SSC。
（4）0.1mol/L NaOH。
（5）硝酸纖維素濾膜。
（6）濾紙。
4、操作步驟：
(1) 10μl 樣品與20μl 100%甲酰胺、7μl 37%甲醛、2μl 20×SSC 混合。混合置于68℃，15分鐘后置冰浴中。
(2) 用0.1mol/L NaOH 清洗點樣器,再用無菌水充分沖洗。將一張經20×SSC 浸潤的濾紙鋪在點樣器上,上面再鋪上一張經20×SSC 浸潤1 小時的硝酸纖維素濾膜，加蓋并夾緊，接通真空泵。
(3) 用10×SSC 清洗各樣孔。在每一樣品中加兩倍體積的2×SSC,混合后加樣于孔中。外圍幾個孔中加2μl 染料定位,緩慢抽吸。每孔用1ml 10×SSC 清洗兩次。繼續抽吸5 分鐘,吸干濾膜。
(4) 取出濾膜,夾在兩張濾紙中間, 80℃真空烘干2 小時。按上述Southern 或Norhtern 雜交所述的方法與放射性標記探針雜交。
[注意]
1、在放射自顯影時應注意濾膜必須干燥，并覆蓋上保鮮膜，否則，濾膜將與X-光片粘在一起，使以后的操作困難。
2、在雜交過程中，整個濾膜應一直是濕潤的，不得干涸。第三節雜交反應的條件及參數的優化
不同的反應條件對雜交結果的影響如下：
(1) 根據雜交液的體積確定雜交的時間：一般來說使用較小體積的雜交液比較好，因為在小體積溶液中，核酸重新配對的速度快、探針用量少，從而使濾膜上的DNA 在反應中起主要作用。但在雜交中必須保證有足夠的雜交溶液覆蓋雜交膜。
(2) 根據所用的雜交溶液確定雜交的溫度：一般來說，雜交相為水溶液時,則在68℃雜交,而在50%甲酰胺溶液中時,則在42℃下雜交。
(3) 選用不同的封閉試劑：如Denhardt's 試劑、肝素或一種由5%脫脂奶粉組成的BLOTTO, 這些試劑中需加入斷裂的鮭魚精子DNA 或酵母DNA，并和SDS 一起使用。與Denhardt's 試劑相比,BLOTTO 價格便宜,使用方便,同樣可獲得滿意的結果，但它不能用于RNA 雜交。一般而言,尼龍膜用Denhardt's 試劑比用BLOTTO 能得到更高的信噪比。對硝酸纖維素濾膜而言,通常在預雜交溶液和雜交溶液中都含有封閉劑。但是對尼龍膜，經常從雜交溶液中省去封閉劑，因為高濃度的蛋白質會干擾探針和目的基因的退火。
(4)根據需要在雜交過程中選用不同的振蕩方法和程度,許多雜交膜一起反應時,連續的輕微振蕩可獲得較好的雜交結果。
(5) 在雜交過程中加入其他化合物, 如反應體系中加入10%硫酸葡聚糖或10% PEG, 雜交速度可增加約10 倍。檢測稀有序列時常用該方法，但它們有時會導致本底較高，并由于溶液的粘稠性而使操作困難。因此，除非在濾膜上含有的目的DNA 量很少,或放射性探針的量有限, 一般不用硫酸葡聚糖或PEG。根據探針與被檢測目標之間的同源程度選擇清洗的程度,如具有很高的同源性可選用嚴緊型洗脫方式（高濃度SSC）, 反之則選用非嚴緊型洗脫方式（低濃度SSC）。洗脫通常在低于雜交體解鏈溫度12-20℃的條件下進行。解鏈溫度(melting temperature, Tm )是指在雙鏈DNA 或RNA 分子變性形成分開的單鏈時光吸收度增加的中點處溫度。通常富含G?C 堿基對的序列比富含A?T 堿基對序列的Tm 溫度高。有關Tm 的計算方法，請參考第八章。
(7) 根據標記探針的濃度及其比活性,選擇不同的雜交條件及檢測方法。一般使用新的同位素可獲得較強的信號。在水溶液中雜交時,用6×SSC 或6×SSPE 溶液的效果都一樣。但在甲酰胺溶液中雜交時,應該用具有更強緩沖能力的6×SSPE。上述這些條件的改變，對雜交的結果有不同的影響，應根據研究的具體情況，選用適當的方法。

思考題：
1、核酸探針的標記方法有哪些？
2、要獲得好的雜交結果，需注意哪些因素？
3、如果放射自顯影后，如X-光片背景很黑，請分析原因及寫出預防措施。

第十章測序技術

　　在分子生物學研究中，DNA 的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用于測序的技術主要有Sanger 等（1977）發明的雙脫氧鏈末端終止法和Maxam 和Gilbert（1977）發明的化學降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，產生A，T，C，G 四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE 膠上電泳進行檢測，從而獲得DNA 序列。目前Sanger 測序法得到了廣泛的應用。Sanger 法測序的原理就是利用一種DNA 聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP 缺乏延伸所需要的3-OH 基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T 或C 處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs 和ddNTPs 的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千堿基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。

第一節非同位素銀染測序系統操作技術

一、概述：

　　Promega 公司的SILVER SEQUENCETM DNA 測序系統是一種無放射性的序列分析系統，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。銀染提供了一種對于放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到；電泳完成后經90 分鐘就可讀序，這是常規的放射性測序法做不到的。此外, SILVER SEQUENCETM 系統用未修飾的5'OH 寡聚核苷酸作為引物， 減少了特殊修飾寡聚核苷酸的花費。該系統不需要放射性方法中對同位素的謹慎操作，也不需要熒光法或化學發光技術的昂貴試劑。另外，也不需要象大多數熒光法那樣用儀器來檢測序列條帶。Taq