聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）分離血清蛋白質（三）

3）電位梯度的不連續性

電位梯度的高低與電泳速度的快慢有關，因為電泳速度等于電位梯度與遷移率的乘積。遷移率低的離子，在高電位梯度中可以與具有高遷移率而處于低電位梯度的離子具有相似的速度。在不連續系統中，電位梯度差異是自動形成的。電泳開始后，由于快離子的遷移率最大，就會很快超過蛋白質，因此在快離子的后邊形成一個離子濃度低的區域即低電導區。

電導與電位梯度是成反比的：

式中E為電位梯度，I為電流強度，η為電導率。

所以低電導區就有了較高的電位梯度。這種高電位梯度使蛋白質和慢離子在快離子后面加速移動。

當快離子、慢離子和蛋白質遷移率和電位梯度的乘積彼此相等時，則三種離子移動速度相同。

在快離子和慢離子的移動速度相等的穩定狀態建立之后，則在快離子和慢離子之間形成一個穩定而又不斷向陽極移動的界面。也就是說在高電位梯度區和低電位梯度區之間的地方形成一個迅速移動的界面（圖15-6）。由于蛋白質樣品的有效遷移率恰好介于快、慢離子之間，因此也就聚集在這個移動的界面附近，被濃縮形成一個狹小的中間層。

4）pH的不連續性

在濃縮膠與分離膠之間有pH的不連續性，這是為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率。要求在樣品膠和濃縮膠中，慢離子較所有被分離樣品的有效遷移率低，以使樣品夾在快、慢離子界面之間，使樣品濃縮。而在分離膠中慢離子的有效遷移率比所有樣品的有效遷移率高，使樣品不再受離子界面的影響。

①濃縮膠應有的pH值

②分離膠應有的pH值

在分離膠中要求甘氨酸有效遷移率（m_Gα_G）超過所有的蛋白質的有效遷移率。這樣甘氨酸的泳動速度即超過所有蛋白質，使分離膠保持均一的pH及電位梯度，以便蛋白質樣品在其中進行普通的電泳分離和分子篩分離（如圖15-5C所示）。

血清中的前清蛋白在7.5%凝膠中的遷移率小于-0.5單位，則m_Gα_G至少應為-5.0。即α= 1/3，按上述計算pH應為9.5。實際上Davis所用的配方中，分離膠的pH值為8.9。但在電泳分離時，根據實際測定證明與理論計算相符，實際上比原制備時的pH約高出半個pH單位，所以與要求的數值是符合的。

2．分子篩效應

分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質通過一定孔徑的分離膠時，受阻滯的程度不同，因此表現出不同的遷移率，即所謂分子篩效應。即使凈電荷相似，也就是說自由遷移率相等的蛋白質分子，也會由于分子篩效應在分離膠中被分開。

此處分子篩效應是指樣品通過一定孔徑的凝膠時，小分子走在前面，大分子走在后面。而在柱層析方法中的分子篩作用，則是大分子通過凝膠顆粒之間的縫隙先流出，而小分子則通過凝膠顆粒內的孔道后流出。

3．電荷效應

蛋白質混合物在凝膠界面處被高度濃縮，堆積成層，形成一狹小的高濃度的蛋白質區，但由于每種蛋白質分子所載有效電荷不同，因而遷移率不同。承載有效電荷多的，泳動的快，反之則慢。因此各種蛋白質就以一定的順序排列成一個一個的圓盤狀。在進入分離膠中時，此種電荷效應仍起作用。