T7DNA聚合酶測序技術

一、概述

T7 DNA聚合酶最初具有5'→3'聚合酶活性以及單鏈和雙鏈3'→5'外切酶活性。當T7 DNA聚合酶用適當方法處理后，可使3'→5'外切酶活力明顯下降。改造后的T7 DNA聚合酶又稱T7測序酶。使用T7測序酶得到的測序數據具有在每個堿基位置都有相對均勻的配對參入。因此, 放射自顯影所得到的結果較為清晰易辯，對于許多模板來說，使用含有dGTP的混合物即可得到理想的測序結果。然而，如果出現了帶壓縮的問題，則用含dITP的混合物來取代常規的dGTP。dITP的摻入，使在富含GC的模板中也能有效地消除帶壓縮現象。

T7測序酶具有很高的聚合速度，并有高度的延續性，正因如此，該酶在使用中不同于Klenow片段和反轉錄酶。它幾乎沒有錯誤性的終止，整個反應在很短的時間內完成，并且不需要進行追加反應（Chase step）。然而對于有緊密二級結構的區域，錯誤的終止反應會給閱讀序列帶來困難。如果碰到這些情況，應使用一些高溫DNA聚合酶，如Promega公司的測序級Taq DNA 酶。利用高溫DNA聚合酶獨有的耐熱特性，測序反應可在不利于形成二級結構的高溫條件下進行。

T7 DNA聚合酶測序的快速而簡便的方法是從Klenow酶和AMV反轉錄酶測序的操作步驟修改而來的，它的最大優點是具有很高的5'-3'的DNA合成活性和極低的3'-5'端外切酶的活性。在測序過程中，若以同位素標記則相對于大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段Klenow，或反轉錄酶AMV而言，則可使條帶非常的均一，并且它的放射性背景極低。

T7 DNA聚合酶測序時DNA的合成的過程是分二步完成的。第一步為標記反應階段，第二步方為雙脫氧鏈末端終止的DNA合成過程。在第一步過程中，引物的延伸是在較低濃度的脫氧三磷酸核苷酸的存在下完成的，在此反應過程中，已含有經放射性標記的dATP。第二步過程中，脫氧三磷酸核苷酸濃度提高，并且加入雙脫氧的三磷酸核苷酸，DNA 在合成過程中，因加入的雙脫氧三磷酸核苷酸而隨機終止，形成長短不一的DNA片段。

二、材料

待測的DNA模板，可用雙鏈或單鏈模板。

三、設備

高壓電泳儀，測序用電泳槽，照相顯影用大號塑料盆，制膠設備，吹風機，放射自顯影盒，X光片。

四、試劑

1、5×T7 DNA聚合酶緩沖液：200mmol/L Tris·Cl，pH7.5，100mmol/L MgCl2，250mmol/L NaCl。

2、引物：使用通用引物pUC/M13正向或逆向引物。

3、DTT：0.1mol/L。

4、5×常規標記混合物：7.5mmol/L dGTP，7.5mmol/L dCTP，7.5mmol/L dTTP。

5、5×dITP標記混合物：15mmol/L dITP，7.5mmol/L dCTP，7.5mmol/L dTTP。

6、dNTP A溶液（適用于dGTP）：80mmol/L dGTP，80mmol/L dATP，80mmol/L dCTP，80mmol/L dTTP，50mmol/L NaCI。

7、ddG終止混合物（適用于dGTP）：dNTP A溶液再加8mmol/L ddGTP。

8、ddA終止混合物（適用于dGTP）：dNTP A溶液再加8mmol/L ddATP。

9、ddT終止混合物（適用于dGTP）：dNTP A溶液再加8mmol/L ddTTP。

10、ddC終止混合物（適用于dGTP）：dNTP A溶液再加8mmol/L ddCTP。

11、dNTP B溶液（適用于dITP）：160mmol/L dITP，80mmol/L dATP，80mmol/L dCTP，80mmol/L dTTP，50mmol/L NaCl。

12、ddG終止混合物（適用于dITP）：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddGTP。

13、ddA終止混合物（適用于dITP）：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddATP。

14、ddT終止混合物（適用于dITP）：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddTTP。

15、ddC終止混合物（適用于dITP）：dNTP B溶液再加1.6mmol/L ddCTP。

16、測序用T7 DNA測序酶。

17、酶稀釋緩沖液：10mmol/L Tris·HCl，pH7.5，5mmol/L DTT，0.5mg/ml BSA 。

18、終止溶液：95%甲酰胺，20mmol/L EDTA，0.05%溴酚蘭，0.05%二甲苯蘭。

19、[a-32P]dATP 或[a-35S]-dATP，35S的優點是可使條帶為窄而清晰，并且操作更為安全。放射強度為：1000～1500Ci/mmol，10mCi/ml。

20、TE緩沖液：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH7.5。

21、上節所述的凝膠制備過程中的全套試劑。

22、X光顯影液：H2O：50℃ 800ml，米吐爾 2.2g，無水Na2SO3 72g，對苯二酚 8.8g，無水NaCO3 48g，KBr 4g， 定容至1000ml備用。

23、F-5堅膜定影液：水600ml，Na2S2O3 240g，Na2SO3 15g，冰醋酸 13.4ml；硼酸 7.5g ，粉狀鉀礬 15g ，定容至1000ml 備用。

24、TYP肉汁培養基：16g蛋白胨，16g酵母提取物，5g NaCl，2.5g K2HPO4，加水溶解，定容至1000ml。

25、20%PEG/3.75mol NH4Ac 溶液：40% PEG（分子量8000）儲備液和7.5mol/L pH7.2 NH4Ac儲備液等體積混合。

五、操作步驟

（一）模板制備
　　
1、M13單鏈模板制備：

在轉化入合適的大腸桿菌宿主菌且在含有指示劑如X-gal/IPTG的培養基上鋪板之后，含有M13重組子的細胞將表現出無色的“噬菌斑”，事實上受感染的細胞并非被噬菌體溶菌或殺死，出現噬菌斑是因為被感染的細菌在生長速度上比其周圍未感染的細菌慢的緣故，從無色噬菌斑上得到的感染細胞經培養便能產生測序反應所需的單鏈模板。

（1）過夜培養的宿主細胞（如NM522或JM101）用3ml TYP肉汁培養基以1：100稀釋。在37℃強烈震蕩1小時之后，細胞進入對數早期。此時，將一個合適的含有重組M13的噬菌斑（連同瓊脂）用滴管轉入該細胞培養液中。

（2）37℃強烈震蕩（300rpm）培養6小時。

（3）把細胞培養液轉入兩只1.5ml eppendorf管，12000g離心15分鐘。上清液轉移到新的eppendorf管再離心15分鐘。小心地取出1～1.2ml上清液（注意不能觸及沉淀），再轉到新的eppendorf管。

（4）將0.25體積的含20%PEG（-8000）的3.75M醋酸銨（pH7.5）加入上清液以沉淀噬菌體。混勻后置冰上30分鐘，再以12000g離心15分鐘，傾去上清液，再以同樣方法離心一次，用吸液器尖頭將殘留的PEG充分吸干凈。此時應能見管底有芝麻大小的噬菌體顆粒沉淀。

（5）將沉淀物重溶于400ml TE緩沖液中。

（6）加等體積氯仿/異戊醇（24：1）混合液，強烈震蕩1分鐘，12000g離心5分鐘。

（7）將水相轉入一新的eppendorf管，注意不能觸動原管中兩相交界面。加等體積苯酚/氯仿（1：1）混合液，強烈振蕩1分鐘，12000g離心5分鐘。

（8）將上層水相轉入另一新的eppendorf管，重復第7步的提取，如有必要重復多次直至二相之間無可見物質存在。

（9）將上層水相轉入一新的eppendorf管，加等體積氯仿，強烈振蕩1分鐘后，12000g離心5分鐘，多次重復此步驟。

（10）將上層水相轉入新的eppendorf管，加0.5倍體積的7.5 mol/L醋酸銨，2倍體積乙醇，混勻后-20℃放置30分鐘。

（11）12000g離心15分鐘，去除上清液，用70%乙醇小心清洗沉淀，如果沉淀已被攪起，重新離心，傾去酒精，真空干燥沉淀物。

（12）將DNA的沉淀物溶解于20ml去離子水中，取2ml樣品進行瓊脂糖凝膠電泳定量，如果DNA量充足，則可進行退火測序。

2、噬粒（Phagemid）單鏈模板的制備：

噬粒是指含有絲狀單鏈DNA噬菌體復制區的嵌合質粒。分子克隆中常用的pBluescript系列和pGEM系列的質粒均屬噬粒。含重組噬粒的細胞單菌落經液體培養并用輔助噬菌體超感染后就能產生測序反應所需的單鏈DNA模板。

（1）從新鮮平板上挑得含pGEM質粒DNA的抗Amp單菌落，并接種到100ml含有50mg/ml氨芐的TYP肉湯培養基中，在37℃振蕩過夜

（2）取100ml過夜培養物接種到另一新的裝有5ml含50mg/ml Amp的TYP肉汁培養基的試管中，在37℃強烈振蕩30分鐘。

（3）加40μl輔助噬菌體R408或M13 K07，繼續劇烈攪拌振蕩培養6～8小時，使輔助噬菌體超感染。

（4）12000g離心15分鐘后，去除沉淀，取上清，轉移到一新eppendorf管中再次離心15分鐘，小心地取1～1.2ml上清液（注意不能觸及沉淀）。

（5）將0.25體積的含20%PEG的3.75M醋酸銨加入上清液以沉淀噬菌體顆粒。混勻后置冰上30分鐘，再以12000g離心15分鐘，傾去上清液，再以同樣方法離心一次，用移液器尖頭將殘留的PEG溶液吸凈。此時應能看到管底有芝麻大小的噬菌體顆粒沉淀。

（6）將沉淀物溶解于400ml TE緩沖液（10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA）。

（7）加等體積氯仿/異戊醇（24：1）混合液，強烈振蕩1分鐘，再以12000g離心5分鐘。

（8）將水相轉入一干凈eppendorf管（不要觸動原管中兩相交界面），加等體積酚/氯仿（1：1）混合，強烈振蕩1分鐘，12000g離心5分鐘。

（9）上層水相轉入一干凈eppendorf管重復第8步驟提取，如有必要重復多次直至二相之間無可見物質。

（10）將上層水相轉入一干凈eppendorf管加等體積氯仿，強烈振蕩1分鐘后離心，多次重復此步驟。

（11）將上層水相轉入一干凈eppendorf管加0.5倍體積7.5mol/L pH7.5醋酸銨，再加2倍體積乙醇，混和后-20℃放置30分鐘。

（12）12000g離心15分鐘，去除上清液，用70%乙醇小心清洗沉淀，如沉淀已被攪，重新離心，傾去乙醇，真空干燥沉淀。

（13）將沉淀物溶解于20ml去離子水中，取2ml樣品進行瓊脂糖凝膠電泳進行定量，如果DNA量充足，則進行退火和測序。

3、質粒膜板制備：參照第一章所述的方法。