原子力顯微鏡法測量納米粒子的尺寸

原子力顯微鏡（Atomic Force Microscopy, AFM）是繼掃描隧道顯微鏡（Scanning Tunneling Microscopy, STM）之后發明的一種具有原子級高分辨的新型儀器，可以在大氣和液體環境下對各種材料和樣品進行納米區域的物理性質包括形貌進行探測。本標準文本將概述納米粒子的原子力顯微鏡樣品制備，以及納米粒子尺寸的原子力顯微鏡法測量。相對于掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscopy，SEM），原子力顯微鏡具有高分辨、樣品表面的三維成像、對樣品無破損等優點。但是相對于納米粒子在溶液中的狀態，AFM樣品制備過程可能會改變納米粒子的形貌和聚集狀態。 

　1 原理

　　原子力顯微鏡工作原理如圖1所示，其使用彈性懸臂（對微弱力非常敏感）上的針尖在樣品表面作光柵式掃描。當針尖和樣品表面的距離非常接近時，針尖尖端的原子與樣品表面的原子之間存在極微弱的作用力（10-12-10-6 N），此時，微懸臂就會發生微小的彈性形變。針尖與樣品之間的作用力F與微懸臂的形變之間遵循胡克定律：F=-kx ，其中，k為微懸臂的力常數。所以，只要測出微懸臂形變量的大小，就可以獲得針尖與樣品之間作用力的大小。針尖與樣品之間的作用力與距離有依賴關系，所以在掃描過程中利用反饋回路保持針尖與樣品之間的作用力恒定，即保持為懸臂的形變量不變，針尖就會隨樣品表面的起伏上下移動，記錄針尖上下運動的軌跡即可得到樣品表面形貌的信息。這種工作模式被稱為“恒力”模式（Constant Force Mode），是使用最廣泛的掃描方式。原子力顯微鏡成像也可以使用“恒高”模式（Constant Height Mode），也就是在XY掃描過程中，不使用反饋回路，保持針尖與樣品之間的距離恒定，通過測量微懸臂Z方向的形變量來成像。這種方式不使用反饋回路，可以采用更高的掃描速度，通常在觀察原子、分子像時用得比較多，而對于表面起伏比較大的樣品不適用[1]。 

　　原子力顯微鏡有多種操作模式，常用的有以下三種：接觸模式（Contact Mode）、非接觸（Non-Contact Mode）、輕敲模式(Tapping Mode)。根據樣品表面不同的結構特征和材料的特性以及不同的研究需要，選擇合適的操作模式。 

　　(1)接觸模式﹕針尖始終與樣品保持輕微物理接觸，以恒高或恒力的模式進行掃描。掃描過程中，針尖在樣品表面滑動。通常情況下，接觸模式都可以產生穩定的、高分辨率的圖像。在接觸模式中，如果掃描軟樣品的時候，樣品表面由于和針尖直接接觸，有可能造成樣品的損傷，因此圖像可能會發生扭曲或得到假像。所以接觸模式一般不適用于成像生物大分子、低彈性模量樣品以及容易移動和變形的樣品。 

　　(2)非接觸模式﹕針尖在樣品表面上方振動，始終不與樣品接觸，探針監測器檢測的是范德華力和靜電力等對成像樣品無破壞的長程作用力。這種模式雖然增加了顯微鏡的靈敏度，但當針尖與樣品之間的距離較長時，分辨率要比接觸模式和輕敲模式都低，而且成像不穩定，操作相對困難，在生物中的應用也比較少。 

　　(3)輕敲模式﹕微懸臂在其共振頻率附近作受迫振動，振蕩的針尖輕輕的敲擊樣品表面，間斷的和樣品接觸，所以又稱為間歇接觸模式。由于輕敲模式能夠避免針尖粘附到樣品上，以及在掃描過程中對樣品幾乎沒有損壞。輕敲模式的針尖在接觸表面時，可以通過提供針尖足夠的振幅來克服針尖和樣品間的粘附力。同時，由于作用力是垂直的，表面材料受橫向摩擦力、壓縮力和剪切力的影響較小。輕敲模式同非接觸模式相比較的另一優點是大而且線性的工作范圍，使得垂直反饋系統高度穩定，可重復進行樣品測量。本標準步驟采用輕敲式掃描來得到納米粒子的尺寸。

　　2 儀器　　

　　本實驗中所用的原子力顯微鏡儀器為Dimension 3100（美國Veecco公司生產，橫向分辨率～1 nm，縱向分辨率～0.2 nm）[2]。儀器的校準應該不少于每年一次。

　　3 試劑和基片

　　丙酮(AR, ≥99.5%)、乙醇(CP, 95%)、超純水、原子力顯微鏡樣品基片 

　　4 樣品制備

　　4.1 基片的選擇：溶液中的納米粒子需要分散到平整的基底上。為了保證高度測量的準確，基底表面的粗糙度要遠遠小于納米粒子的尺寸。常用的基片有HOPG、高質量的云母、原子級平整的金（111）面（沉積在云母上）和單晶硅片等。根據納米粒子的具體情況選擇合適的基片。

　　4.2  基片的處理：對于HOPG和云母基底，直接用膠帶剝離表層以獲得新鮮的平整表面。對于原子級平整的金（111）面（沉積在云母上），直接購買的基底保存在真空容器中，然后直接取出使用即可。對于硅基片，首先從直徑4英寸的硅片上切取約5mm×5mm的小片，然后清洗硅片。清洗硅片的步驟為：先把硅片放入丙酮中超聲3分鐘，之后再放入乙醇中超聲3分鐘，然后放入超純水中超聲3分鐘。最后用超純水沖洗硅片，并用氮氣吹干。硅片的清洗也可以使用氧氣等離子體進行清洗。

　　4.3 納米粒子在基片上的分散：用移液器吸取20μL納米粒子溶液滴加到準備好的基片上，放進真空干燥器中，等溶劑揮發完全，備用。

　　5 測量步驟

　　5.1 開機：依次打開電腦主機、原子力顯微鏡控制器和軟件。

　　5.2 針尖的安裝：探針是由懸臂和其一段的尖銳的針尖組成的。懸臂和針尖的性能尺度決定了原子力顯微鏡的靈敏度和分辨率。針尖的關鍵參數的參考值：100－500kHz共振頻率，力常數在10-80 N/m范圍，針尖頂端曲率半徑小于12nm。一般商業的AFM針尖一般滿足上述要求。

　　5.3 光學顯微鏡定位測量點：使用原子力顯微鏡內置的光學顯微鏡，找到樣品上合適的成像位置，并將原子力顯微鏡針尖移動到該位置。

　　5.4 設置成像模式：選擇輕敲模式。

　　5.5 設置掃描參數：原子力顯微鏡圖像有橫向（XY）和垂直（Z）分辨。針尖的曲率半徑決定了最高的橫向分辨率。然而，還有一個因素在圖像分析中需要考慮，即是數據點數，或者叫像素。例如，得到一個10μm ×10 μm的圖像，512像素，那么像素尺寸即是19.5 nm。因此10 μm掃描范圍，不可能得到小于19.5 nm物體的真實圖像。因此選擇掃描范圍的時候，根據納米粒子的尺寸選擇合適的掃描范圍。

　　5.6 采集圖像：先掃比較大的范圍以便找到納米粒子較均勻分布的區域，找到理想區域后，縮小掃描范圍，開始收集納米粒子圖像。通過調節振動振幅來保證trace和retrace線近于重合。保存圖像在電腦的文件夾并命名，以備圖像處理和分析。

　　6 數據分析

　　6.1 圖像拉平（Flatten）：通常，原子力顯微鏡圖像處理的第一步是逐行拉平以除去圖像采集過程中的一些失真信息。例如，樣品不總是完美地和針尖垂直，導致測到的圖像中樣品表面出現實際上并不存在的傾斜或翹起的現象。別的信號失真來源還包括熱漂移和掃描管的非線性。拉平技術通過多項式擬合每一條掃描線，可以修正這些信號失真，并把它們從數據中去除掉。通常線性拉平就足以去除這些失真信息。在納米粒子出現的情況下，拉平處理變得有點困難了。軟件試圖對基底和納米粒子同時做多項式擬合，而非只對基底進行擬合。為了消除拉平處理過程中的這個因素的影響，大多數AFM軟件包包括“排除點”功能。基本上這個功能將在拉平過程中排除所有選擇的點，從而在拉平基底的過程中有效忽略這些納米粒子。

　　6.2 橫截面輪廓分析：原子力顯微鏡軟件包中另一個常用功能是橫截面工具。在圖像的任意部分劃橫截面線，沿這條線的垂直輪廓即會顯現出來。光標移動可以進行水平、垂直和角向測量。對一個納米粒子做幾條橫截面線，不僅可以計算粒子高度，而且可以確定納米粒子是否孤立，是否處在平面區域邊緣。 

　　6.3 高度測量：通過每一個納米粒子畫一條橫截面線，如圖2所示。用光標找到基線的平均值和峰高。如果拉平過程做得合適（即納米粒子在拉平過程中被排除），基線沿掃描線會相對平整。從峰高中減去平均基線高度，可以得到納米粒子的高度。對至少100個納米粒子重復這個過程以便作統計分析。大的團聚和外來粒子應該從平均數據中排除出去。

                                                   圖2 利用橫截面線輪廓分析獲得納米粒子的高度

   　6.4 自動批處理模式粒子分析方法：大多數軟件包提供了自動粒子分析功能。用閾值法，基于像素的高度數據，軟件可以測量粒子高度并畫出直方分布圖。在進行批處理之前，必須進行上述拉平處理以保證基底平整。通過調整高度閾值，閾值以上的粒子都會被包括在分析范圍，閾值以下的粒子將被排除在外。選擇一組粒子之后，來自粒子和基底的最大高度間的間距可以被自動測量出來，并且高度平均值和粒子標準差可以被計算出來。批處理高度分析使得研究者可以在較短時間內對大量粒子進行分析。

　　6.5 粒子尺寸分析報告：根據以下步驟來計算粒子高度分布的平均值和擴展的不確定度。粒子高度平均值或代數平均值X的計算公式如下：

　　其中n是測量的粒子數，Xi是每個粒子的高度。描述平均值變化的最常用方法是標準偏差，或者更簡單的均方差： 

　因此，粒子的尺寸可以表示為：X+uX。