qPCR結果分析經驗分享

　　Real-time qPCR就是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以成為定量的依據。由于常規的PCR的缺點，real-time qPCR由于其操作簡便，靈敏度高，重復性好等優點發展非常迅速。設在已經涉及到生命科學研究的各個領域，比如基因的差異表達分析，SNP檢測，等位基因的檢測，藥物開發，臨床診斷，轉基因研究等。

　　qPCR 的數據相對定量分析其實很簡單。我做了很多的 qPCR 實驗，也看了很多的資料，包括Nature protocol， AB官方的分析教程，MIQE，甚至包括一些商業化軟件使用的教程及教程里面記述的原理。

　　我在這里跟大家分享一下自己的經驗，最常用，最普遍的相對定量方法就是2^-△△Ct法，該法最最簡單的說就是：

　　首先將一次實驗的所有基因Ct值整理好，之后用每一組樣本自身的目的基因Ct值減去自身內參基因Ct值，得到的數就是△Ct；換成公式就是：△Ct=Ct（目的基因）-Ct（內參基因）；

　　然后，將每一組樣本每一個目的基因的△Ct都算好，整理進Excel，用本次實驗中待研究樣本的△Ct減去對照組樣本的△Ct，并同時對所有結果取相反數（就是加一個負運算，正數就變成負數，負數就變成正數），該步運算得到的結果就是-△△Ct。

　　最后，對-△△Ct 進行2的冪運算，即2^-△△Ct就得出 Fold Change。

　　但是，我想說的是2^-△△Ct得出的是Fold Change，不僅數據結果看上去不直觀反應實驗組與對照組目的基因mRNA的情況，同時還具有放大效應，所謂放大就是本來A基因的-△△Ct得到為2，B基因-△△Ct為4，兩者相差2，經過2的冪運算之后，A基因為4，B基因為16，兩者相差12！

　　相對定量本身就存在放大的情況，若是再采取2^-△△Ct就只能說看看趨勢而已了，所以我在這里給大家推薦ABi官方的一個分析方法，就是log2R，就是log2為底對R求對數。當相對定量分析時，默認擴增效率E趨近或等于100%，這時候R就是2^-△△Ct，當然原本的R的公式我會在后面附上，感興趣的朋友可以自己去推導。

　　所以，我用的方法就是只計算到-△△Ct這一步就夠了，這樣得到的數據就有了正值與負值，正值表示較對照組 mRNA 上調，負值表示較對照組mRNA下調，作出圖來非常直觀，一目了然，也沒有放大效應，顯著性分析較為靠譜。這種運算方法最關鍵的在于負號以及實驗組和對照組要分清楚！要不就得到相反的結果。

　　附上 R 的完整公式：

　　R=(1+E1)^△Ct1(Control-Sample)/(1+E2)^△Ct2(Control-Sample)

　　其中，E1：為目的基因引物擴增效率；E2：為內參基因引物擴增效率；△Ct1：為實驗組目的基因Ct值差；△Ct2：對照組目的基因Ct值差。

　　你觀察這個公式時候就發現，當擴增效率E為1（即100%）時，該公式就等于2^-△△Ct，這就是為什么會有2^-△△Ct方法的原因！！！

　　ABi官網里的一款商業軟件能直接給出每次試驗每對引物的擴增效率E，能得到較為實際的R值，所以ABi的商業軟件會對R進行log2的運算，進而得到直觀的結果。