流式細胞術在臨床檢驗中的應用

付海龍（蚌埠醫學院研究生部）趙亞萍（解放軍82醫院檢驗科）

流式細胞術（flow cytometry，FCM）是近代細胞生物學、分子生物學、分子免疫學、流體力學、激光技術、電子計算機技術等高度結合和發展的結晶，是一種在功能水平上對單細胞或其他細胞粒子、抗原物質進行快速檢測分析和分選的技術〔1〕。FCM能夠快速分析單個細胞或粒子的多種特性，既可以定性，也可以定量，尤其適用于大量樣品檢測，已在臨床檢驗工作中得到廣泛應用。流式細胞儀（fluorescenceactivated cell sorter，FACS）的檢測分析已涉及到細胞生物學、免疫學、腫瘤學、遺傳學、血液學、微生物學等學科〔2〕，此外，五分類血細胞分析儀以及部分尿沉渣分析儀也都采用了FCM原理。筆者對FCM在臨床檢驗工作中的應用作一綜述。

1、FCM檢測淋巴細胞亞群

    FACS利用各種單克隆抗體與淋巴細胞表面的抗原結合，再配合多色熒光染料，同時檢測一種或幾種淋巴細胞的表面抗原，從而將不同功能的淋巴細胞區分開來，并且得到各亞群的相對比例。最常檢測的淋巴細胞亞群包括CD3^+CD4^+T細胞、CD3^+CD8^+T細胞、B淋巴細胞（CD19^+CD20^+）及NK細胞（CD16^+CD56^+）等。通過對不同亞群淋巴細胞相對計數、絕對計數以及比率的觀察，可以監測感染性疾病、免疫性疾病及腫瘤等疾病狀態下機體的免疫狀況，從而輔助診斷、判斷病情變化〔3〕。例如，CD4^+T細胞膜外CD4分子具有人類免疫缺陷病毒（HIV）識別部位，HIV感染人體后，入侵CD4^+T細胞，大量復制，導致CD4^+T細胞破壞，數量劇減，功能受損，機體免疫機能嚴重缺陷，所以，CD4^+T細胞檢測是獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）診斷及病情觀察的重要指標〔4〕。

2、FCM檢測HLA-B27抗原

    HLA-B27基因是脊柱關節病的易感基因，強直性脊柱炎、反應性關節炎、炎癥性腸病相關關節炎、銀屑病關節炎、幼年脊柱關節炎以及未分化關節炎等疾病的發生與HLA-B27均存在不同程度的相關性。研究表明〔5〕，強直性脊柱炎患者中，HLA-B27抗原陽性率高達91.1%。另外，HLA-B27尚與急性前葡萄膜炎的發生密切相關〔6〕。FACS采用CD3/HLA-B27雙標記抗體，首先鑒定出T淋巴細胞亞群，再分析其細胞表面是否存在HLA-B27組織抗原。檢測HLA-B27可為上述疾病的診斷與鑒別診斷提供重要依據。

3、FCM在腫瘤標志物檢測中的應用

    FACS主要是對腫瘤細胞DNA進行分析以及對腫瘤相關標志物的檢測。正常體細胞均具有較恒定的DNA二倍體含量，DNA二倍體含量改變以及DNA非整倍體細胞群出現，是細胞發生癌前病變或癌變的重要標志。通過對DNA進行染色標記，采用FACS檢測分析，可以精確檢測細胞DNA含量的改變，解析細胞周期，了解細胞的增殖能力，預測腫瘤的預后，指導化療藥物的選擇，確定放療強度、時間。通過對細胞DNA異倍體的監測，還可以為腫瘤的早期診斷及鑒別診斷提供參考〔7〕。另外，FACS還可以檢測分析腫瘤細胞的增殖活性標志分子、分化標志分子、凋亡標志分子以及免疫學標志物，用于腫瘤發病機制的研究、個性化治療方案的制定以及預后判斷等〔7-8〕。

4、FCM在白血病免疫分型中的應用

    正常白細胞在其分化成熟過程中，細胞膜、細胞漿或胞核抗原的出現、表達增多與減少甚至消失，與其分化發育階段密切相關，而且表現出與細胞系列及其分化程度相關的特異性，因此，這些抗原的表達與否，可以作為鑒別和分類血細胞的基礎。白血病是造血系統的惡性腫瘤，雖然血細胞的形態變化非常顯著，但仍能表達正常血細胞所具有的抗原，因而仍可依據其抗原的表達譜對白血病進行免疫分型。FACS利用熒光素標記的單克隆抗體（McAb）作為分子探針，多參數分析白血病細胞的細胞膜、細胞漿或細胞核的免疫表型，由此了解被測白血病細胞所屬細胞系列及其分化程度，已成為白血病免疫分型的主要方法之一。常用的白血病系列分化抗原有：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8（T淋巴細胞），CD10、CD19、CD20、CD22（B淋巴細胞），CD13、CD14、CD33、MPO（髓系細胞），CD16、CD56、CD57（NK細胞），CD41、CD42、CD61（巨核細胞）以及CD34、HLA-DR等非特異性抗原〔8〕。

5、FCM在臨床微生物檢測中的應用

    FACS快速、靈敏以及可以同時進行多參數分析的優點，使其在臨床微生物檢測中的作用受到越來越多的關注。通過熒光染料標記，不僅可以檢測病原菌、毒素和血清抗體，還可用于抗生素敏感性試驗，對抗生素后效應、細菌耐藥的異質性等進行分析。流式微球分析（CBA）技術是FACS檢測細菌病原體的常用方法，微生物抗原與被異性抗體包被的熒光微球結合，由于抗原的遮蔽效應，使熒光微球的發散光減弱，通過檢測發散光強度的變化來進行診斷，應用不同大小的熒光微球，可同時檢測同一標本的多個病原體，這種方法也可用于真菌、寄生蟲、病毒以及這些病原體混合感染的檢測〔9-11〕。FACS體外抗生素藥敏試驗的主要機制是，通過FACS檢測染料與病原體結合后發出的不同熒光強度，間接反映病原體的活性和功能狀態，進而幫助判斷病原體對抗生素的反應性。用于研究抗菌效應的熒光染料主要有兩大類：（1）標記DNA和RNA的染料，如碘化丙啶（PI）、溴化乙錠（EB）等；（2）反映代謝活性或結合蛋白的探針，包括膜電位敏感性染料、異硫氰酸熒光素（FITC）等。這些物質的選擇與其激發與發射特性有關，也與抗生素的作用機制有關。

6、FCM在外周血細胞分析中的應用

    五分類血細胞分析儀是臨床檢驗應用最為廣泛的血細胞分析儀。根據FCM的原理，五分類血細胞分析儀將待測細胞經處理或染色后壓入流動室，與此同時，不含細胞的緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流形成一定角度，這樣鞘液就能包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在包繞下單行排列，依次通過檢測區域，在激光束的照射下產生散射光和激發光。這兩個光源信號分別反映了細胞體積的大小和內部的信息，經光電倍增管接收后可轉換為電信號，再通過模/數轉換器將連續的電信號轉換為可被計算機識別的數字信號。多數血細胞分析儀將FCM與激光散射技術、多角度偏振光散射技術、熒光技術、電導/射頻技術等相結合，共同用于血細胞檢測，從而使檢測結果更加準確、可靠。如BECKMANCOULTRER全自動五分類血細胞分析儀采用其獨特的V（體積法）、C（電導法）、S（散射法）聯合檢測方法，測試時加入溶血劑使紅細胞完全破壞，對流式通道內通過的單列白細胞逐個進行三重檢測以及三維分析〔12〕。SYSMEX五分類血細胞分析儀運用激光流式分析系統結合核酸熒光染色技術和電阻抗技術，檢測時激光散射產生的前向散射光、側向散射光用于探測白細胞體積大小、細胞內含物的情況，側向熒光則反映細胞內DNA和RNA的含量，直流電阻抗法用于測量細胞體積大小，最后綜合各個測量結果，得出各類白細胞的圖形和數據〔13〕。雅培公司的全自動血細胞分析儀運用FCM與多角度偏振散射分離技術。國產邁瑞公司的血細胞分析儀結合了FCM、激光散射技術和化學染色技術〔14〕。

7、FCM在尿沉渣分析中的應用

    目前，一些全自動尿沉渣分析儀也應用了FCM，例如SYSMEXUF系列尿沉渣分析儀就是采用FCM結合熒光染色和半導體激光技術，將檢測通道分為沉渣通道和細菌通道。檢測尿液中的細胞成分時，首先對細胞中的特定物質進行熒光染色并調節到懸浮狀后，使用鞘液包圍此物質，然后通過噴嘴以單柱形式噴出。此時每個尿細胞都將暴露在高度密集的激光束照射之下，單個細胞會按不同角度發出熒光和散射光。熒光反映了細胞表面、細胞質內的性狀以及細胞核的性質，從前向散射光的發光度即可獲知細胞的大小和表面狀態等，系統通過對這些信號進行分析，為尿液中的各種細胞按照熒光強度生成一維直方圖，并按照熒光強度和散射光強度生成二維散點圖，從而進行識別，并做出定量分析〔15〕。

    全自動尿沉渣分析儀在對尿沉渣進行分析的過程中，由于紅細胞在尿液中直徑大約是8.0μm，沒有細胞核和線粒體，所以熒光強度很弱，如果紅細胞在尿液中大小不均一，其前向散射光強度（FSC）差異就會較大，最后分析得出的指標不但提示每微升尿的紅細胞數，而且可以體現紅細胞的均一性。白細胞比紅細胞稍大，前向散射光強度也比紅細胞稍大一些，但白細胞含有細胞核，因此它有高強度的前向熒光，能將白細胞與紅細胞區別開來，白細胞出現在散射圖的正中央。上皮細胞體積大、散射光強，且都含有細胞核、線粒體等，熒光強度也比較強，分析結果可以提示上皮細胞數量以及每微升小圓上皮細胞數。另外，儀器還可以分辨出透明管型，并能提示病理管型的存在〔16〕。

    細菌由于體積小并含有DNA和RNA，所以前向散射光強度要比紅、白細胞弱，但熒光強度比紅細胞強，又比白細胞弱，因此，細菌分布的散射圖出現在紅細胞和白細胞之間的下方區域。酵母菌和精子細胞含有RNA和DNA，熒光強度很高，其散射光強度與紅、白細胞差不多，所以散射圖分布在紅、白細胞之間的區域。由于酵母細胞的前向散射光脈沖寬度小于精子細胞的前向散射光脈沖寬度，據此可將酵母細胞和精子細胞區別開來。結晶出現在散射圖紅細胞區域，但結晶的中心分布不穩定，所以可以與紅細胞區分開來。

    隨著計算機技術、光源、熒光染料、單克隆抗體、標記技術的不斷進步，更高分辨率、更高速度、更多參數FACS的研發，FCM必將進一步推動檢驗技術和檢驗水平的提高。