一文了解外泌體在肺癌中的研究進展

　　肺癌是全世界發病率和病死率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（NSCLC）占所有肺癌類型的85%以上，死亡率高達80%～90%。由于缺乏有效的早期診斷篩查方法，70%肺癌患者確診時已是晚期，5年生存率僅為16%～18%。因此，尋找新的生物標志物和靶向治療的新靶點對肺癌的早期診斷和臨床治療至關重要。近年來，針對外泌體的研究越來越多，大量研究發現外泌體通過與腫瘤微環境相互作用介導腫瘤細胞的生長和轉移、腫瘤免疫調節、放化療抵抗等多方面影響肺癌的發生、發展。此外，外泌體可為肺癌的早期診斷提供重要信息，具有成為肺癌腫瘤標志物的潛力。因此，肺癌外泌體的研究將為肺癌的診斷和治療提供新思路。本文主要從外泌體的生物學功能和臨床應用方面的研究進展作一綜述。

　　外泌體概述

　　外泌體是由多種活細胞通過內吞-融合-外排等一系列生物學機制而形成的具有脂質雙層膜結構的納米級微小囊泡，其密度為1.13～1.21g/mL，直徑約為30～100nm。外泌體最早是在1983年由Johnstone RM等研究羊成熟網織紅細胞過程中囊泡的形成時發現的。外泌體在電鏡下觀察常呈杯型或雙凹碟型，在人體體液中常呈球型，廣泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、乳汁、腦脊液等多種體液中。通常采用超速離心法、過濾離心法、密度梯度離心法、色譜法、免疫磁珠法、聚乙二醇沉淀法等方法提取得到外泌體。外泌體含有大量生物活性物質，如蛋白質、核酸、脂質、病毒和朊病毒等。外泌體中脂質成分主要包括膽固醇、鞘磷脂、卵磷脂、磷酯酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、神經節苷脂、聚甘油磷脂、飽和脂肪酸等，這些脂質結構具有提高細胞膜穩定性的作用。外泌體中含有豐富的蛋白質，主要包括膜運輸和融合相關的蛋白質如Rab蛋白、GTP酶、膜聯蛋白等；細胞骨架成分如肌動蛋白、微管蛋白等；四跨膜蛋白，如CD9、CD63、CD81、CD82等；與外泌體形成相關的蛋白質如腫瘤易感基因101蛋白（TSG101）、ALG-2相互作用蛋白X（ALix）、內體分揀轉運復合物（ESCRT）等；熱休克蛋白如HSP70、HSP60和HSP90。此外，外泌體還包含與細胞來源和組織類型相關的各種特異性蛋白，如主要組織相容性復合體Ⅰ（MHCI）、MHCⅡ、細胞黏附分子等。除蛋白質和脂質外，外泌體還包含大量的核酸，如信使RNA（mRNA）、微小RNA（miRNA）、長鏈非編碼RNA（LncRNA）和DNA等。這些成分在腫瘤微環境內相互作用，在腫瘤的發生發展中發揮著重要的作用。

　　外泌體在肺癌中的生物學作用

　　2.1外泌體在肺癌腫瘤微環境中的作用

　　2.1.1外泌體介導腫瘤血管的生成

　　腫瘤血管是腫瘤細胞生長和發展過程中營養物質的主要來源。大量研究表明，肺癌細胞來源外泌體（LCC-exosome）含有血管內皮生長因子（VEGF）、轉化生長因子（TGF）、miRNA等多種細胞因子。LCC-exosome將自身所含的細胞因子釋放到腫瘤微環境中，通過不同的途徑作用于內皮細胞膜表面受體，促進肺癌新血管的形成，進而促進肺癌細胞的增殖、提高肺癌的侵襲性和轉移力。通過體外實驗發現人類肺癌細胞A549來源的外泌體分泌的分揀蛋白，與酪氨酸激酶受體B和EGFR形成TES復合物在內皮細胞的激活和遷移中起著作用，并在肺癌血管的生成中發揮作用。Kosaka N等發現LCC-exosome釋放的miR-210通過分泌中性鞘磷脂酶2（NSMASE2）抑制特異性靶基因，從而促進腫瘤血管的生成。低氧狀態下誘導A549肺癌細胞向周圍內皮細胞釋放miR-494和外泌體，通過抑制PTEN和Akt/eNOS途徑的激活，促進腫瘤血管的生成。另一項研究發現LCC-exosome分泌的miR-210，通過下內皮細胞中酪氨酸受體激酶A3的水平，促進腫瘤血管生成。由此可見，LCC-exosome可以通過多種途徑介導腫瘤血管的形成，進而調控腫瘤微環境，促進肺癌的生長和轉移。

　　2.1.2外泌體在上皮細胞-間充質轉化形成中的作用

　　上皮細胞間充質轉化（EMT）是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，主要的特征有細胞黏附分子表達的減少、細胞角蛋白細胞骨架轉化為波形蛋白為主的細胞骨架等，EMT是一種能導致腫瘤細胞遷移、侵襲和轉移的生物學過程。Rahman MA等研究發現高轉移性的肺癌外泌體可誘導正常支氣管上皮細胞表達波形蛋白，進而通過波形蛋白來驅動正常支氣管上皮細胞發生EMT，使得受體細胞獲得遷移、侵襲和增殖能力。研究發現肺腺癌A549細胞來源的外泌體釋放的Rab3D蛋白和轉化生長因子-β（TGF-β）能通過不同途徑促進EMT，進而增強了肺癌的侵襲性和轉移性。

　　2.1.3外泌體參與腫瘤相關成纖維細胞形成

　　腫瘤相關成纖維細胞（TAF）由腫瘤基質中固有的纖維細胞轉變形成，是腫瘤微環境的主要基質細胞。研究表明，TAF不僅是腫瘤生長的“土壤”，更能分泌多種細胞因子，與腫瘤微環境中的腫瘤細胞及其他間質細胞相互作用，促進腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移。通過體外實驗發現肺癌A549來源的外泌體表面具有的HSP70能夠刺激肺正常間充質干細胞（MSC）產生一種促炎性間充質干細胞，進一步觸發NF-κB通路快速激活核轉錄因子-κB（NF-κB）/Toll樣受體2（TLR2），使IL-6、IL-8、MCP-1分泌增多，促進肺癌的生長。研究還發現人和鼠肺癌模型細胞來源的外泌體能激活成纖維細胞和內皮細胞，并誘導基質細胞表達血管生成相關因子如IL-8、VEGF、LIF、OSM、IL-11和MMP-9，從而促進肺癌微環境血管生成。因此，LCC-exosome參與腫瘤相關成纖維細胞形成，促進腫瘤細胞的發生、侵襲及轉移。

　　2.2外泌體參與腫瘤免疫調節

　　大量研究表明，外泌體在抑制免疫反應或免疫逃逸過程中起到重要的作用。外泌體包含有一些腫瘤特異性抗原，這些特異性抗原通過激活抗原遞呈細胞（APC）如樹突狀細胞（DC細胞），引起T細胞介導的抗腫瘤免疫反應。Huang SH等研究發現LCC-exosome攜帶的表皮生長因子受體（EGFR）可誘導產生免疫耐受性樹突狀細胞，進而生成特異性調節性T細胞（TREG），TREG具有抑制CD8+T細胞抗腫瘤功能，從而影響肺癌的發生發展。LCC-exosome分泌的miR-21和miR-29A，通過與Toll樣受體（TLR）家族、TLR7和人類TLR8受體結合，觸發TLR介導的NF-κB信號通路活化，最終導致腫瘤生長和轉移。研究證實，外泌體中的配體如MICA、MICB等通過與NKG2D（MEMBERD）受體結合，使NKG2D受體表達下調，抑制淋巴細胞功能，最終導致腫瘤細胞的免疫逃逸。以上結果表明，LCC-exosome可介導腫瘤免疫調節，參與免疫逃逸，促進肺癌的發生發展。

　　2.3外泌體參與腫瘤放化療抵抗

　　腫瘤化療耐藥和放療耐受及抵抗是導致腫瘤侵襲、轉移和復發的重要原因。研究表明，LCC-exosome在肺癌放化療抵抗過程中發揮著重要功能。Xiao X等研究發現當肺癌A549細胞暴露于順鉑（DDP）后，外泌體分泌水平升高，A549細胞釋放的外泌體降低了其他A549細胞對順鉑的敏感性，同時其他A549細胞分泌的外泌體增加了A549細胞對順鉑的抗性。Qin X等研究發現肺癌細胞中提取的外泌體使順鉑對其他癌細胞具有抗性，A549細胞外泌體分泌的miR-100-5P的下調被證實參與了順鉑的抵抗。研究還發現使用吉非替尼處理過的PC9人肺癌細胞系所產生的外泌體降低了順鉑的抗腫瘤作用。此外，Tang Ｙ等研究發現肺癌患者接受60Gy放射治療后含miR-208A的外泌體表達水平升高，進一步激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，最終導致肺癌放療抵抗。以上研究表明，外泌體及其分泌的蛋白質、miRNA通過不同途徑影響著放化療療效。

　　外泌體在肺癌診斷中的作用

　　隨著對肺癌診斷方法研究的深入，目前國內外正在廣泛研究血清生物學標志物聯合低劑量螺旋CT（LDCT）的肺癌診斷策略，通過血清生物學標志物篩查肺癌是目前研究的熱點和趨勢。研究表明，外泌體分泌的miRNA和蛋白質可作為肺癌臨床應用中較理想的新的生物學診斷標志物。Giallobardo M等利用定量聚合酶鏈反應（qPCR）分析NSCLC患者血液中提取的外泌體所分泌的8個miRNA（miR-30B、-30C、103、-122、-195、-203、-221和-222）均與NSCLC相關；Cazzoli R等采用qPCR研究發現肺腺癌患者血液提取的外泌體所攜帶的4種miRNA（hsa-miR-378A、-379、-139-5P和-200B-5P）較健康吸煙者表達水平高，6種miRNA（hsa-miR-151A-5P、-30A-3P、-200B-5P、-629、-100和-154-3P）在肺腺癌中表達水平明顯高于肺肉芽腫患者；Rodriguez M等研究發現肺癌患者血液中外泌體含有的miR-122-5P表達量高于支氣管肺泡灌洗液（BALF）所分離的量。Vanni I等研究發現肺癌患者血液外泌體來源的miR-25和miR-223的表達水平較正常人升高，而let-7F、miR-20B和miR-30E-3P的表達水平前者較后者明顯降低，這種差異性表達為肺癌的診斷帶來潛在應用價值。此外，外泌體蛋白質也可以作為肺癌標志物。Huang SH等研究發現從NSCLC患者組織提取分離的外泌體蛋白質中約80%含有EGFR，在肺部慢性炎癥患者中只有約2%的外泌體蛋白含有EGFR；另一項研究采用EV陣列分析法研究表明外泌體蛋白可作為晚期NSCLC的潛在診斷標志物。通過免疫印跡和免疫組織化學法研究發現肺癌患者尿液來源的外泌體中的人富亮氨酸α2糖蛋白1（LRG1）是NSCLC非侵入性診斷的候選生物學標志物。Ueda K等通過對1369個外泌體蛋白進行質譜定量分析，發現CD91可作為鑒別肺腺癌特異抗原的外泌體，CD91聯合癌胚抗原（CEA）可作為肺癌診斷標志物，兩者聯合檢測的靈敏度和特異度均高于單獨檢測CEA。以上研究表明，外泌體的相關miRNA和蛋白質檢測將為肺癌患者的早期發現、早期診斷提供更可靠的依據。

　　外泌體在肺癌治療及預后評估中的作用

　　大量研究已經證明外泌體的相關研究對肺癌的治療起著重要的作用。目前存在四種潛在的治療策略：①抑制外泌體的產生或分泌，降低外泌體含量。MARLEAｕAM等利用一種AETHLONADPT血漿置換技術，將含有外泌體的血液過濾，發現針對性減少外泌體的含量可能成為治療肺癌新技術；②外泌體可作為抗腫瘤疫苗。研究表明DC細胞來源的外泌體（DEX）可激活CD4+和CD8+T淋巴細胞產生抗腫瘤作用。因此，外泌體可作為疫苗用于肺癌的治療新手段。研究發現在晚期NSCLC患者中，DEX疫苗是可行的，其治療耐受性良好。脂質體疫苗BLP-25、TG4010等可能在肺癌免疫治療中起作用，需進一步進行實驗驗證。BESSEB等采用DEX疫苗治療NSCLC患者進行Ⅱ期臨床試驗，證實了在晚期NSCLC患者中，DEX能夠增強自然殺傷細胞（NK）的抗腫瘤作用；③外泌體可作為藥物傳送載體。外泌體膜與親本細胞膜的組成相近，可直接與靶細胞膜融合，同時具有穩定性、細胞靶向性，可作為藥物傳送載體的理想顆粒。Aqil F等將組裝的南蛇藤素-外泌體復合體（EXO-CEL）在A549和H1299肺癌細胞系中進行體外實驗發現外泌體復合物抗腫瘤效果較好。通過實驗組裝形成的外泌體-紫衫醇復合物藥效高于單獨應用paclitaxel；④外泌體可作為肺癌治療新靶點。研究發現外泌體let-7的表達水平與肺癌的發生發展具有顯著的相關性，提示外泌體let-7可作為肺癌治療的新靶點。此外，研究表明外泌體在肺癌的治療中具有潛在的預后評估價值。Munagala R等通過檢測小鼠肺癌模型中腫瘤和血清外泌體的miRNA在原發和復發性肺癌中的表達水平變化，發現復發性肺癌中外泌體miR-21和miR-155顯著升高，證明這兩種外泌體miRNA的表達水平與肺癌復發風險具有一定的相關性。研究還發現外泌體miR-29A-3P和miR-150-5P的表達水平具有預測肺癌放療相關毒性的價值。

　　外泌體與循環腫瘤細胞（CTC）、血漿游離DNA（cfDNA）同為液體活檢的重要組成，液體活檢將為腫瘤的精準醫療開辟新紀元，外泌體的研究也越來越熱門。盡管目前對外泌體在肺癌生物學作用、診斷、治療、預后評估中的應用價值已有大量的研究和探索，然而外泌體促進肺癌發生發展的機制還需要進一步深入的研究，仍需要對外泌體作為肺癌診斷標志物進行大樣本的驗證和謹慎分析確定。隨著對外泌體生物學結構及功能的進一步研究，以及更深入的理解外泌體在肺癌發生發展中的生物學機制，相信外泌體在肺癌的診斷和治療上將有廣闊的前景，有望研發出新的抗腫瘤靶向藥物及臨床腫瘤干預的一系列措施。