“即用型”CART療法有未來么？

　　自CAR-T療法在2017年首次獲批以來，這一突破性療法的臨床前和臨床期開發出現了爆發式的增長。去年的ASH年會上，楊森（Janssen）/南京傳奇、百時美施貴寶（BMS）、吉利德科學/Kite Pharma、和諸多中國生物醫藥公司開發的CAR-T療法亮出令人驚艷的數據。今年，更可能有2款以上CAR-T療法獲得FDA批準上市，將獲批療法的數目翻倍。

　　然而，獲批的CAR-T療法雖然在治療血液癌癥時展現出優異和持久的療效，但是它的推廣卻面臨著多種挑戰。目前獲批上市的CAR-T療法為自體（autologous）CAR-T療法，這意味著醫生需要從患者體內獲取T細胞，在體外通過基因工程在T細胞表面表達針對癌癥抗原的嵌合抗原受體（CAR），然后將增殖后的細胞輸回患者體內。這一繁瑣的生產過程可能耗時長達3周，而且成本不菲。有些患者因為身體健康水平，前期治療等多種原因，無法提供足夠的T細胞，導致他們不能從這一突破性技術中獲益。

　　從健康供體中獲得細胞制造同種異體（allogeneic）CAR-T細胞有潛力解決自體CAR-T細胞面對的這些挑戰。新年伊始，Nature Reviews Drug Discovery上發表的一篇綜述對“即用型”同種異體CAR-T療法的開發現狀進行了深度盤點。

　　同種異體CAR-T細胞的優勢和挑戰

　　同種異體CAR-T細胞的制造流程起始于從健康供體中獲得的T細胞或者其它細胞類型，這些細胞在經過基因工程改造，在細胞表面表達能夠靶向癌細胞的CAR之后，接受進一步基因編輯降低異體CAR-T細胞攻擊宿主的風險和宿主細胞排斥異體CAR-T細胞的可能。然后這些細胞經過培養、增殖、提純、分裝成可以隨時使用的產品冷凍保存。

　　這種CAR-T療法的優勢在于：

　　從單一健康供體提供的細胞可以生成大量CAR-T細胞，滿足大量患者的需求。例如，致力于開發同種異體CAR-T細胞的Allogene公司表示，從一名健康供體中獲得的細胞可以制成治療100名癌癥患者的CAR-T療法。

　　這些細胞已經生成并且冰凍在庫存中，需要接受治療的患者只需要解凍庫存的療法就可以立即接受治療，消除了自體CAR-T療法制造過程中產生的延遲。

　　而且，通常癌癥患者由于自身T細胞數目的限制，導致他們無法接受多次CAR-T療法的治療。而同種異體CAR-T療法可以更容易重復對患者進行治療，并且改變CAR-T療法靶向的抗原，克服對CAR-T療法的抗性。

　　然而，同種異體CAR-T療法的開發也需要面對獨特的兩大挑戰：一，輸入患者的異體細胞可能對宿主進行攻擊，導致危及患者生命的移植物抗宿主病（GVHD）；二，異體細胞可能迅速被宿主的免疫細胞識別并消滅，限制它們的抗腫瘤活性。

　　解決移植物抗宿主病的策略

　　同種異體CAR-T細胞攻擊宿主組織的原因是因為這些T細胞表面表達的T細胞受體（TCR）能夠識別宿主組織上的異體抗原，從而引發T細胞對宿主組織的攻擊。目前，克服移植物抗宿主病的策略主要分為兩類，一類使用基因編輯方法消除T細胞上的天然TCR表達，另一類使用其它不會導致GVHD的細胞類型。

　　基因編輯方法消除T細胞的天然TCR表達

　　由于常用的αβ型T細胞表面天然表達的TCR是介導這些T細胞攻擊宿主的關鍵。研究人員已經開發出多種方法，防止TCR在這些細胞表面的表達。其中進展最快的方法是使用基因編輯技術。αβ型T細胞表面的TCR蛋白復合體由α鏈和β鏈構成，只有一個基因編碼α鏈的恒定區（constant regions）。因此，破壞編碼T細胞受體α鏈恒定區（TRAC）的基因是阻止αβ型TCR表達直接有效的方法。利用這一策略產生的同種異體CAR-T療法已經進入臨床試驗。

　　這一策略的優勢在于，可以使用健康供體中大量的αβ型T細胞作為原材料制造CAR-T細胞。目前有多種基因編輯技術可以用于特異性破壞編碼TRAC的基因，它們包括鋅指核酸酶（ZFN），轉錄激活子樣效應因子核酸酶（TALEN），MegaTAL，和CRISPR基因編輯系統。在最新研究中，研究人員利用細胞的同源重組機制，將表達CAR的轉基因直接導入TRAC基因的位點。這一策略具有“一石二鳥”的效果，在破壞T細胞的天然TCR表達的同時，讓CAR轉基因在TRAC基因的位點表達，接受天然TCR基因啟動子的調控。動物試驗表明，這種策略產生的靶向CD19的CAR-T療法比隨機插入CAR轉基因生成的CAR-T療法具有更好的抗癌活性。

　　使用基因編輯策略的一個隱患是基因編輯技術的脫靶效應可能產生潛在風險。然而，由于異體細胞最終都會被宿主消滅，這一潛在風險的影響可能相對較低。

　　使用降低GVHD風險的細胞類型

　　降低異體CAR-T細胞攻擊宿主風險的另一個策略是使用不會產生GVHD或產生GVHD風險較低的細胞類型。它們包括天然殺傷細胞（NK細胞），γδ型T細胞，NK T細胞（表達NK細胞表面標志物的T細胞），病毒特異性記憶T細胞。

　　提高同種異體CAR-T細胞持久性的策略

　　雖然上述的多種方法可以降低輸入到患者體內的異體CAR-T攻擊宿主的風險，但是同種異體CAR-T療法還需要解決另一項重大挑戰，那就是患者的免疫系統會識別這些細胞是“外來”細胞，從而對它們產生免疫排斥反應。這種免疫排斥最終會將輸入患者體內的異體CAR-T細胞完全消滅。而由患者自身T細胞介導的免疫反應可能在異體CAR-T療法輸入時就馬上開始工作，降低異體CAR-T療法的療效。因此，如何提高同種異體CAR-T療法的持久性是這一領域急需解決的問題。目前解決這一問題的研究沿著下面的幾個方向進行：

　　更為有效的淋巴細胞清除手段

　　已有的研究已經表明，想讓輸入的CAR-T細胞在患者體內增殖，需要在輸入細胞之前先使用化療等手段清除患者體內已有的淋巴細胞，從而為輸入的CAR-T細胞提供增殖的空間。對于同種異體CAR-T細胞來說，清除淋巴細胞這一步可能更為重要，因為殘存的宿主T細胞會立刻攻擊“外來”的CAR-T細胞。

　　目前一種在研方法是通過基因編輯讓同種異體的CAR-T細胞對清除T細胞的藥物產生抗性，這些細胞就不會受到清除T細胞藥物的影響。例如，Allogene公司開發的UCART19使用基因編輯手段，敲除了細胞表達CD52蛋白的基因。這讓這些細胞對通過與CD52相結合，殺死T細胞的單克隆抗體alemtuzumab產生抗性。將alemtuzumab與化療聯用可以更有效地清除宿主的成熟T細胞，并且將宿主的成熟T細胞維持在低水平。與此同時，同種異體的CAR-T療法仍然可以發揮作用。

　　基因編輯還可以讓同種異體的CAR-T細胞對清除T細胞的化療藥物產生抗性，從而讓它們在抑制T細胞生長的環境中正常工作。然而，這一策略的弊端在于患者體內的內源T細胞水平會被壓制到很低的水平，導致他們感染的風險顯著提高。

　　降低同種異體CAR-T細胞的免疫原性

　　器官移植和造血干細胞移植的經驗表明，如果供體的主要人類白細胞抗原（HLA）表型與宿主的HLA表型相似，就可以大幅度減少對移植物的免疫排斥。基于這一經驗，理論上可以通過發現具有特定HLA表型的供體，構建供體細胞庫，從中選擇與患者匹配的供體細胞生成同種異體CAR-T細胞。

　　由于1類HLA蛋白是介導免疫排斥因素的關鍵分子。另一種策略是使用基因工程手段，消除同種異體CAR-T細胞表面表達的1類HLA蛋白。HLA在細胞表面的表達需要名為β2-microglobulin的亞基，通過基因工程敲除β2-microglobulin的表達就可以防止HLA蛋白在細胞表面的表達，從而降低這些細胞的免疫原性。

　　選擇最佳的T細胞亞群

　　T細胞群體包含多種具有不同功能和表型的T細胞亞群。而不同T細胞亞群在攻擊癌細胞的能力和在患者體內的持久性等方面表現也大不相同。例如，臨床前研究表明，由CD8陽性和CD4陽性幼稚T細胞（na？ve T cell，TN）和中央記憶細胞（central memory T cells，TCM）生成的CAR-T細胞對癌細胞的殺傷能力更強。

　　而使用自體CAR-T療法治療慢性淋巴細胞白血病的臨床研究表明，TCM和具有自我復制能力的干細胞樣記憶性T細胞（stem-like memory T cell， TSCM）的質量，以及細胞耗竭生物標志物的表達水平（包括PD-1， TIM3，LAG3等），是CAR-T療法活性和持久性的重要指標。

　　因此，通過改進篩選和細胞培養技術，可以富集特定的T細胞亞群，從而改善療法的持久性。在這一方面，從健康供體中獲得的T細胞可能具有潛在的優勢，因為他們沒有接受過可能影響T細胞群體的前期療法的治療，因此可以提供包含豐富TN，TCM，和TSCM的T細胞。

　　同種異體CAR-T療法的臨床進展

　　目前，多項在研同種異體CAR-T療法已經進入臨床試驗，治療急性淋巴細胞白血病和急性髓系白血病（ALL）患者等血液癌癥和實體瘤（見下表）。

　　2018年的ASH年會上，Allogene公司開發的UCART19的初步臨床結果表明，在治療復發難治型ALL患者時，UCART19達到82%的完全緩解/血液學不完全恢復的完全緩解（CR/CRi）。由于UCART19在患者體內的持續時間有限，接受UCART19的兒科患者隨后接受了造血干細胞移植療法。

　　CAR-T和細胞療法的未來

　　關于“即用型”CAR-T療法，業內也有著兩派不同的觀點。許多人相信，它能解決CAR-T療法難以制備，生產周期長的痛點，為全球更多病患帶來治療的新希望；但也有一些專家相信，“即用型”CAR-T療法只是一時的“權宜之計”。歸根結底，是我們對“自體型”CAR-T療法的洞見還不夠深刻。

　　Lyell Immunopharma的創始人兼首席執行官Rick Klausner博士展望了細胞療法的未來。這名美國國家癌癥中心（NCI）的前負責人指出，目前研發“即用型”CAR-T療法的動力之一，在于當下制造“自體型”CAR-T療法的種種瓶頸。然而我們需要認識到，當下制造CAR-T療法的技術遠未臻成熟。5-10年后，細胞療法的研發與生產制造勢必將與現在大不一樣。

　　Klausner博士提到，目前的細胞療法生產之所以耗時費力，在于我們并不知道其中的哪些細胞真正具有治療的效力。因此我們只能不斷擴增T細胞，希望在天文數字的細胞中，具有療效的細胞數能夠達標。而在未來，如果我們能分離出那些具有療效的細胞亞群，就能大幅降低治療癌癥所需的細胞數目。這能極大地減少我們所需培養的細胞數量，并把細胞療法的生產時間從數周縮短到短短幾天。

　　這聽起來像是天方夜譚，卻代表了未來的一個前進方向。要知道，在一臺計算器要占去一整間房屋的時代，也沒有多少人能預想到智能手機的出現。而兩者之間，相隔只有數十年。

　　MD安德森癌癥中心的癌癥醫學部主任Patrick Hwu博士則指出了不同的應用前景。對于某些比較敏感的癌癥來說，“即用型”的CAR-T療法在短期內就能起到很好的效果，因此不必過于擔心它被免疫系統所排斥的問題。而對于實體瘤，我們希望T細胞在腫瘤附近停留盡量久的時間，“自體型”的CAR-T療法則會有更大的發揮空間。

　　而我們要知道，關于“即用型”和“自體型”CAR-T療法的熱議，只是細胞療法的冰山一角。是的，自獲批以來，CAR-T療法領域吸引了大量的目光和關注。但兩位專家指出，細胞療法，并不是只有CAR-T療法一種。T細胞療法以外的細胞療法，同樣是未來的發展方向。而基因與細胞療法有望在生物技術的浪潮之下，為全球病患帶來新的突破。