NCB：李鑫組揭示核糖體介導piRNA的形成

　　piRNA (PIWI-Interacting RNA) 是一類與PIWI蛋白相互作用的非編碼小RNA，其長度在24—35nt左右，主要存在于動物的生殖細胞中。piRNA與PIWI蛋白結合形成PIWI/piRNA分子機器，其主要作用之一是沉默減數分裂過程中被激活的轉座子（Transposon）——一種可以在基因組中自我復制并插入到其他位置的外緣遺傳片段。在轉錄后基因沉默（Post-transcriptional gene silencing）中，piRNA通過堿基互補配對尋找靶標，而PIWI蛋白負責切割靶標RNA，將這些RNA降解。在piRNA的引導下，大量轉座子RNA被沉默，使得基因組的完整性得以維持。此外 PIWI/piRNA復合物還可以招募其他蛋白通過表觀遺傳的方式調控基因表達。

　　在小鼠生殖細胞的減數分裂中，第一次減數分裂前期可被細分為五個時期，其中粗線期（pachytene）時期產生了生殖細胞內超過95%的piRNA【1】。這些piRNA被稱作粗線期 piRNA，它們的前體（precursor）主要是來自于基因間區段（intergenic region）的長非編碼RNA（long non-coding RNA），目前在小鼠基因組中已發現100個這樣的基因。piRNA生成（piRNA biogenesis）發生在線粒體外膜上。這一過程需要一系列蛋白復合物的參與，將小RNA從長非編碼RNA上剪切下來，并加工為成熟的piRNA【2】。粗線期piRNA是如何產生的一直是領域內研究的熱門問題，但仍有很多機制并未被揭示。

　　2020年2月3日，美國羅徹斯特大學李鑫博士團隊在Nature Cell Biology雜志上以長文形式在線發表了題為Ribosomes guide pachytene piRNA formation on long intergenic piRNA precursors的研究，首次發現核糖體介導粗線期piRNA的形成，揭示了核糖體的又一種新功能。

　　本文中，研究者通過核糖體印記測序（Ribo-seq）和小RNA測序（small RNA sequencing）,在排除Ribo-seq中piRNA污染的情況下，發現核糖體廣泛結合在piRNA前體上，并且其5′端和成熟piRNA的5′端高度重合。通過研究發現：核糖體停留在piRNA前體上的位置確定了成熟piRNA的產生位置。然而這一結果也帶來了新的疑問：核糖體如何穩定停留在長非編碼RNA上？

　　通過分析Ribo-seq數據，同時利用翻譯抑制劑Harringtonine以及Mov10l1和Tdrd5兩種突變體，研究者發現這些長非編碼RNA的5′端存在很短的上游開放閱讀框（UpstreamOpen Reading Fragment, uORF）。在小鼠中，39個piRNA前體上的uORF只包含一個開放閱讀框（single-ORF），而其余61個piRNA前體上的uORF包含多個開放閱讀框（multi-ORF）。核糖體印記（Ribosome Footprint）在這些開放閱讀框內呈現3nt的周期性，同時可以檢測到蛋白表達產物，說明這些開放閱讀框可被核糖體翻譯。在RNA解旋酶Mov10l1突變體中【3】，核糖體印記在uORF的末端停止，并不能繼續移動到uORF的下游區域（UDR，uORF Downstream Regions）上，piRNA也無法產生，說明MOV10L1促進核糖體進入UDR區域。值得一提的是，此前密歇根州立大學Chen Chen博士團隊發現Tdrd5突變體小鼠精巢中粗線期piRNA顯著降低，但靠近piRNA前體5′端的區域依然能產生與野生型相當的piRNA，僅下游的piRNA產生受到影響【4】。通過合作研究，本文發現piRNA前體上的uORF可以很好地解釋Tdrd5突變體中觀測到的現象：uORF部分的piRNA產生未受影響，而UDR區域的piRNA顯著降低。

　　最后本文在現有的piRNA生成模型上提出了新的模型【5】。新模型將piRNA生成分成兩個階段：1，核糖體在靠近5′端的uORF上翻譯階段；2，核糖體在MOV10L1的促進下在UDR上移動階段。在第二階段中，核糖體停留的5′端位置會被線粒體外膜上具有核酸內切酶活性的PLD6切割，這一過程產生的RNA片段隨后被進一步加工為成熟piRNA。此外，本文還通過研究雞和蜥蜴精巢中的核糖體印記及piRNA，揭示了核糖體參與piRNA生成這一發現具有跨物種保守性。

　　本項研究的第一作者為美國羅徹斯特大學博士研究生孫禹，第二作者為朱江博士、謝力和李紫威博士。本項研究的合作者包括美國俄亥俄州立大學宋馳博士，美國密歇根州立大學Chen Chen博士，法國里昂大學Emiliano P. Ricci博士以及美國馬薩諸塞州大學醫學院翁志萍博士。

　　參考文獻

　　1. Li, X. Z., Roy,C. K., Dong, X., Bolcun-Filas, E., Wang, J., Han, B. W., ... & Zamore, P.D. (2013). An ancient transcription factor initiates the burst of piRNAproduction during early meiosis in mouse testes. Molecular cell, 50(1), 67-81.

　　2. Czech, B.,Munafò, M., Ciabrelli, F., Eastwood, E. L., Fabry, M. H.,Kneuss, E., & Hannon, G. J. (2018). piRNA-guided genome defense: Frombiogenesis to silencing. Annual review of genetics, 52, 131-157.

　　3. Vourekas, A.,Zheng, K., Fu, Q., Maragkakis, M., Alexiou, P., Ma, J., ... & Wang, P. J.(2015). The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNAprocessing. Genes & development, 29(6), 617-629.

　　4. Ding, D., Liu,J., Midic, U., Wu, Y., Dong, K., Melnick, A., ... & Chen, C. (2018). TDRD5binds piRNA precursors and selectively enhances pachytene piRNA processing inmice. Nature communications, 9(1), 127.

　　5. Gainetdinov,I., Colpan, C., Arif, A., Cecchini, K., & Zamore, P. D. (2018). A singlemechanism of biogenesis, initiated and directed by PIWI proteins, explainspiRNA production in most animals. Molecular cell, 71(5), 775-790.