藥品的分析方法驗證

(二)法規要求

ICH在1995年和1996年分別發布了Q2A“分析步驟驗證-定義和術語”和Q2B“分析步驟驗證-方法學”;ISO17025于2005年發布的“檢測和校準實驗室通用要求”第“5.4.5”章節中對分析方法驗證提出了非常具體的規定和要求。另外，美國藥典(USP)、歐洲藥典(EP)、日本藥局方(JP)和中國藥典(ChP)都有專門的附錄收載分析方法驗證指導原則。

分析方法驗證的驗證參數

不同國家和地區的藥品監管機構以及不同國家和地區的藥品監管機構以及際組織都有各自的分析方法驗證指導原際組織都有各自的分析方法驗證指導原則，不同指導原則中要求的驗證參數也不同指導原則中要求的驗證參數也不盡相同。

方法驗證建立

方法驗證主要由方法建立者進行，方法建立者必須要證明所建立的方法能夠滿足期望的檢測用途。由于大部分藥品質量控制方法是由生產企業建立，因此方法學驗證的工作大部分是由企業的分析方法研發部門來進行。

企業的研發部門在建立質量控制方法時，需要對該方法進行充分的驗證。在方法驗證的過程中，為了證明方法可行，就要對方法學涉及的相關參數進行驗證，具體驗證哪些參數和方法的用途有關。

分析方法驗證的檢測項目

鑒別

鑒別的目在于判定被分析物是標化合，而非其它物質，用于鑒別的分析方法要求具有較強的專屬性。鑒別方法可分為物理常數測定、化學鑒別方法、光譜鑒別和色法譜鑒別法。

例如： 2015 版《中國藥典—苯妥英鈉的【鑒別】

雜質檢查(限度試驗和定量試驗)

雜質檢查主要用于控制主成分以外的雜質。了解藥物中雜質的來源，可以有針對性地制定雜質檢查項目和檢查方法。雜質檢查可分為限度試驗和定量試驗兩種情況。

例如：2015版《中國藥典》—阿司匹林的【檢查】

定量測定(含量測定、溶出度、釋放度等)

定量測定包括含量測定、制劑的溶出度測定等，由于此類項目對準確性要求較高，故所采用的分析方法要求具有一定的專屬性、準確度和線性。常用的含量測定方法包括化學法、儀器法分析法和生物學法。

例如：2015版《中國藥典》—苯妥英鈉的【含量測定】

其他特定檢測項目

其他特定檢測項目包括粒徑分布、旋光度、分子量分布等，由于這些檢測項目的要求與鑒別、雜質檢查、定量測定等有所不同，對于這些項目的分析方法驗證應有不同的要求。

分析方法驗證的一般原則

原則上每個檢測項目采用的分析方法，均需要進行驗證。

方法驗證的內容應根據檢測項目要求，結合所采用分析特點確定。

同一分析方法用于不的檢測項目會有驗證要求。

例如，采用高效液相色譜法用于制劑的鑒別和雜質定量試驗應進行不同要求的方法驗證，前者重點要求驗證專屬性，而后者重點要求驗證專屬性、準確度、定量限。

分析方法驗證的具體內容

1.專屬性

鑒別反應

鑒別試驗應確證被分析物符合其特征。專屬性試驗要求證明能與可能共存的物質或結構相似化合物區分，需確證含被分析物的供試品呈正反應，而不含被測成分的陰性對照呈負反應，結構相似或組分中的有關化合物也應呈負反應。

雜質檢查

雜質檢查應確保可檢出被分析物中雜質的含量，在雜質可獲得的情況下，可向供試品中加入一定量的雜質，證明雜質與共存物質能得到分離和檢出，并具適當的準確度與精密度。否則，通過與另一種已證明合理但分離或檢測原理不同、或具較強分辨能力的方法進行結果比較來確定。

含量測定

含量測定目的是得到供試品中被分析物的含量或效價的準確結果。在雜質可獲得的情況下，對于主成分含量測定可在供試品中加入雜質或輔料，考察測定結果是否受干擾，并與未加雜質和輔料的供試品比較測定結果。

2.線性

線性系指在設計的測定范圍內，檢測結果與供試品中被分析物的濃度(量)直接呈線性關系的程度。

線性是定量測定的基礎，涉及定量測定的項目，如雜質定量試驗和含量測定均需要驗證線性。應在設計的測定范圍內測定線性關系。

3.范圍

范圍系指能夠達到一定的準確度、精密度和線性，測試方法適用的試樣中被分析物高低限濃度或量的區間。

4.準確度

準確度系指用該方法測定的結果與真實值或認可的參考值之間接近的程度。有時也稱真實度。一定的準確度為定量測定的必要條件，因此涉及到定量測定的檢測項目均需要驗證準確度，如含量測定、雜質定量試驗。

5.精密度

精密度系指在規定的測試條件下，同一均質供品經多次取樣進行列檢測所得結果之間的接近程度(離散) 。精密度一般用偏差、標準或相對標準偏差表示。用或相時，取樣測定次數應至少 6次。

6.檢測限

檢測限系指試樣中的被分析物能夠被檢測到的最低量，但不一定要準確定量。該驗證指標的意義在于考察方法是否具備靈敏的檢測能力。因此對雜質限度試驗，需證明方法具有足夠低的檢測限，以保證檢出需控制的雜質。

7. 定量限系指試樣中的被分析物能夠被定量測定的最低量，其測定結果應具有一定的準確度和精密度。

定量限體現了分析方法是否具備靈敏的定量檢測能力。雜質定量試驗，需考察方法的定量限，以保證含量很少的雜質能夠被準確測出。

8. 耐用性系指測定條件發生小的變動時，測定結果不受影響的承受程度。

耐用性主要考察方法本身對于可變試驗因素的抗干擾能力。開始研究分析方法時，就應考慮其耐用性。如果測試條件要求苛刻，則建議在方法中予以寫明。

9.系統適應性實驗

對一些儀器分析方法，在進行方法驗證時，有必要將分析設備、電子儀器與實驗操作、測試樣品等一起當作完整的系統進行評估。

對分析方法驗證的評價

有關方法驗證評價的一般考慮

1.鑒別

用于鑒別的分析方法要求具有較強專屬性 , 以證明所采用的分析方法能將可共存的物質或結構相似化合區分。同時，由于一種析方法基被某一特定基團或結構，因此采用種分析方法不太可能完全鑒別被析的目標化合物，故通常采用 2種或 2種以上分析方法，而且采用不同原理的析方法作為鑒別項，如一種采用化學而另色譜以加強鑒別項目整體的專屬性。

2、雜質檢查——雜質限度檢查

雜質限度試驗一般需要驗證專屬性和檢測限，而對于精密度、線性、定量限等涉及定量測定的項目，則一般不需要進行驗證。

對于可獲得的雜質，如合成中的起始原料、各中間體、聚合物、副產物，均應進行主藥與雜質的分離度試驗，并且不僅檢測主藥的最低檢測限，也要考察各雜質的最低檢測限，以證明在現有的條件下能有效檢查雜質。由于部分雜質或降解產物不能直接獲得，因此，一般均需進行破壞性試驗，在人為設定的劇烈條件下使藥物降解，考察主藥與降解產物之間的分離度和檢測靈敏度，驗證所擬定的方法能否有效檢出藥物在生產、放置、貯存、使用過程中可能產生的雜質。

制劑有關物質檢查方法驗證時，除了應考慮原料藥關注的內容，還應關注輔料以及輔料降解產生的降解產物對檢測方法可能帶來的干擾，因此在進行破壞性試驗時，輔料應在相同條件下進行實驗，考察輔料的降解。提供空白輔料的實驗結果，證明輔料對實驗結果無干擾。當輔料對實驗結果存在干擾時，應盡量完善方法，以消除輔料的干擾。

有關物質檢查分析方法通常采用高靈敏度、高精度的高效液相色譜法(HPLC法)。由于薄層色譜法(TLC法)檢測靈敏度低,定量精度差,因此TLC法主要用于HPLC法難以檢測的有關物質檢查中。

3.方法驗證的整體性和系統性

方法驗證內容之間相互關聯，是一個整體。因此不論從研發角度還是評價角度，方法驗證均注重整體性和系統性。

例如，對于鑒別項目所需要的專屬性，一般一種分析方法不太可能完全鑒別被分析物，此時采用兩種或兩種以上分析方法可加強鑒別項目的整體專屬性。

在方法驗證內容之間也存在較多的關聯性，可以相互補充。如原料藥含量測定采用容量分析法時，由于方法本身原因，專屬性略差，但假如在雜質檢測時采用了專屬性較強的色譜法，則一般認為整個檢測方法也具有較強的專屬性。

總之，由于實際情況較復雜，在方法驗證過程中，不提倡教條地去進行方法驗證。方法如何進行驗證需要具體情況具體分析，而不能照搬指導原則。

分析方法再驗證

在某些情況下，如原料藥合成工藝改變、制劑處方改變、分析方法發生部分改變等，均有必要對分析方法再次進行全面或部分驗證，以保證分析方法可靠，這一過程稱為方法再驗證。

再驗證原則：根據改變的程度進行相應的再驗證。

方法再驗證是對分析方法的完善過程，應根據實際改變情況進行再驗證，從而保證所采用的分析方法能夠控制藥品的內在質量。