誘導動物細胞融合的方法

　　為什么滅活的仙臺病毒能作細胞融合的誘導劑？

　　問題的提出

　　在新冠肺炎疫情下，科研人員加緊在研究新冠病毒（SARS－CoV-2），不斷有新的研究成果產生，如要徹底了解該病毒的結構和侵染機理，還需要一段時間，甚至可能要較長的時間。要知道，人類與病毒的斗爭看不到盡頭，僅僅是認識第一個病毒－煙草花葉病毒，就花了41年的時間。只有搞清楚病毒的結構和侵染機理，才能有找到或研制相應的藥物治療和疫苗來預防。

　　問題：動物細胞的融合過程中常用的生物誘導劑是滅活的仙臺病毒，仙臺病毒是怎么樣的一種病毒？為什么仙臺病毒能誘導動物細胞的融合？

　　01

　　誘導細胞融合的方法

　　動物細胞的融合原理是細胞膜具有一定的流動性，誘導細胞融合的方法有三種：生物方法－病毒、化學方法－聚乙二醇（PEG）、物理方法－離心，震動，電刺激。

　　生物方法可以用某些病毒，如：仙臺病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒的被膜中有融合蛋白，可介導病毒同宿主細胞融合，也可介導細胞與細胞的融合，因此可以用紫外線滅活此類病毒后誘導細胞融合。

　　化學和物理方法可造成膜脂分子排列的改變，去掉作用因素之后，質膜恢復原有的有序結構，在恢復過程中便可誘導相接觸的細胞發生融合。

　　02

　　細胞融合技術的發展過程

　　生物方法融合：

　　1957年， 岡田善雄意外發現仙臺病毒（HVJ），能誘導懸液中小鼠艾氏腹細胞（EAC）融合。然后Harris、Kada等用于誘導種間細胞融合，獲得成功。

　　化學方法融合:

　　1972年，卡爾森首先用硝酸鈉進行煙草兩個種的細胞原生質體的融合，1974年Kao等，首先發現聚乙二醇（PEG）能誘導植物細胞原生質體融合產生雜交細胞。

　　1975年Pentecorvo發現PEG也能幫助哺乳類動物細胞的融合，1976年，Davidson更進一步證實這一結果，并且認為其具有簡單快速、高效率等優點。因而，1975年之后聚乙二醇就逐漸取代了仙臺病毒。

　　電融合法電融合法:

　　70年代未期和80年代初期發展起來的一種新的細胞融合方法。1970年，Senda首先應用電脈沖， 通過微電極在顯微鏡下使植物細胞融合，奠定電融合技術基礎。

　　激光誘導卵細胞融合:

　　激光誘導方法是最新的細胞融合方法，該法為張聞迪等人在1988年首先應用，他們利用激光微束的單色性、高功率密度、短脈寬和極小的作用范圍等特點。對泥鰍受精卵進行融合試驗，獲得成功，且融合后的細胞可存活發育，經卵裂期、囊胚期、原腸期、孵化期、直至幼魚。整個過程可通過顯微鏡觀察，還可同時由電視攝象監視器觀察和進行照相記錄。

　　03

　　仙臺病毒及其促融原理

　　仙臺病毒屬于副黏病毒科呼吸道病毒屬，仙臺病毒最早在日本仙臺一實驗室分離出來，為單股負鏈RNA病毒（一方面復制產生正鏈RNA，另一方面可以轉錄出mRNA），直徑100～200nm，具有相對堅固的核衣殼，外面包有布滿長8～15nm，寬2～4nm纖突的含脂蛋白囊膜。（圖注：有染色體是因為RNA和有些蛋白質發生了結合）

　　嚙齒類動物是仙臺病毒感染的自然宿主，大鼠、小鼠、倉鼠和豚鼠自然條件下均可感染，新生乳鼠和未成年小鼠最為易染，可引發嚴重的肺炎，并在3-4天死亡。病毒主要通過直接接觸和空氣傳播傳染，由呼吸道進入體內，在上呼吸道進行復制后進入氣管和支氣管中感染。

　　幾乎可凝集所有種類的紅血球，而且有溶血性。在雞胚、各種動物腎臟培養細胞的細胞質中增殖。被感染的細胞株很易引起繼發感染。因為具有融合各種細胞的能力，所以被廣泛地用來進行細胞的異核體形成和培育雜種細胞。

　　1.促進細胞融合的基本原理

　　滅活的仙臺病毒無感染力，但有抗原性。所謂滅活的HVJ是RNA已經完全失活，只留下細胞膜融合能力的衣殼蛋白包膜活性。仙臺病毒的HN蛋白可與細胞膜外的受體結合，通過F蛋白的作用，引起細胞膜融合。

　　在HVJ－E中，仙臺病毒的基因組RNA已經完全失活，在人類和實驗動物體內不存在感染或增殖。因而不需要特殊的操作和設備，它可以安全地在普通的實驗室使用。

　　基本原理在于仙臺病毒含有細胞表面受體的結合位點，通過細胞表面吸附（步驟1），細胞通過HVJ-E相互連接（步驟2），可以促使不同細胞凝聚，最終使細胞膜利用強疏水性結合力進行相互融合（步驟3）。直接產生這種作用的部位是HVJ病毒的外殼，而不是內部的RNA。

　　但是應用HVJ技術有很多缺陷，如細胞感染率低，融合速度慢，反應條件高，融合體的去病毒困難等。目前的細胞融合技術主要采取聚乙二醇（PEG），電刺激融合等技術。

　　2.仙臺病毒誘導細胞融合的四個階段（懸浮法）

　　（1）兩種動物細胞或原生質體在一起培養，加入病毒，在4℃條件下病毒附著在細胞膜上，并使兩細胞相互凝聚。

　　（2）在37℃中，病毒與細胞膜發生反應，細胞膜受到破壞，此時需要Ca2+和Mg2+，最適pH為8.0－8.2。

　　（3）細胞膜連接部穿通，周邊連接部修復，此時需Ca2+和ATP。

　　（4）兩個原生質體的細胞核互相融合，兩個細胞融為一個巨大細胞，仍需ATP 。

　　（5）進入正常的細胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細胞。

　　另外，仙臺病毒除了可廣泛用于基因治療用載體，還可用于構建活載體疫苗。仙臺病毒載體在疫苗上的應用主要是基于其能夠激發較強的細胞免疫，可用于傳統方法無法實現的疫苗。