更快、特異性更好的生物分析

位于英國亞倫維克的賽諾菲-安萬特藥物公司的藥物代謝與藥物代謝動力學部門，為全球各分公司的科學研究提供生物分析的技術支持。每天都需要分析各種各樣生物樣品：從早期的非臨床、臨床研究實驗樣品到后來的三期臨床試驗以及生物等效性實驗樣品等。面對生物分析中越來越多的挑戰，該公司生物分析部門將TurboFlow在線樣品前處理技術和先進的多通道技術的TLX系統與FAIMS技術相結合，幫助實驗室不僅滿足精確性和精密度這兩個首要考察因素，同時還獲得了高通量、分析方法適用性好等優勢。

面臨的挑戰

位于英國亞倫維克的賽諾菲-安萬特藥物公司的藥物代謝與藥物代謝動力學部門，為全球各分公司的科學研究提供生物分析的技術支持。生物分析部門主管Stuart McDougall 以及生物分析質譜專家Michael Blackburn所在的團隊需要分析各種各樣生物樣品：從早期的非臨床、臨床研究實驗樣品到后來的三期臨床試驗以及生物等效性實驗樣品等。該研究團隊有兩個最重要的任務：準確而快速地提供最佳分析結果以滿足法規要求。

復雜基質樣品，如血漿樣品、尿液樣品等，使該團隊所裝備的三重四極桿質譜儀幾乎達到分析極限能力。這些樣品還會經常出現干擾，導致分析結果無效。準確性和精確度是兩個最關鍵指標，同時實驗室必須具備每周分析數千個樣品的能力，以滿足緊急的項目期限要求。賽諾菲-安萬特團隊采用了互補性的解決方案——TLX 系統和高場非對稱波形離子遷移譜（FAIMS），幫助他們同時滿足準確性、精確度以及高通量分析的挑戰。

全自動的在線樣品制備

Stuart McDougall 和 Michael Blackburn在1999年采用了TLX-1系統，配置Thermo Scientific TurboFlow全自動在線樣品制備技術。由于TLX-1系統能夠顯著提高樣品通量，實驗室給予系統很好的評價。在MS/MS系統上實現生物樣品直接進樣，TurboFlow方法實際上節省了傳統的樣品處理時間。在安裝TLX-1系統前，賽諾菲-安萬特團隊的每個成員每天能夠處理一塊96孔板,采用該系統后，每個成員每天能夠處理三塊96孔板，使工作效率提高了300%。分析人員只需將樣品以及內標（IS）加入96孔板，將其混勻和離心，然后放到自動進樣器上進行分析。現在，節約的時間都用于整理報告、處理文檔和方法開發。

該研究團隊甚至采用TLX系統處理常見問題，如樣品殘留等。McDougall說：“這個問題以前經常困擾我們。如今實驗室采用TurboFlow柱并連續進四針血漿離心上清液樣品，定量下限能夠低至10pg/ml。”TurboFlow方法適合處理復雜基質樣品，如尿液樣品和血漿樣品離心上清液。該方法結合嚴格的認證程序，可開發適用性很強的分析方法。由于其無與倫比的適用性，賽諾菲-安萬特團隊已經為實驗室的所有質譜系統配置了TLX系統。

圖1.  處于定量下限濃度（LLOQ）的目標物的代表性LC-MS/MS譜圖。

“在使用TurboFlow技術前，開發分析方法是個非常復雜的過程， McDougall說，“我們曾經碰到努力了三、四個月，也沒開發出合格的分析方法的情況。現在我們的運行失敗率可以控制在5%以內，即在質量控制或者標準曲線分析中，二十塊樣品板中最多有一塊不合格。我們花了大量時間進行方法確認，所以從未由于樣品重復性而導致實驗失敗。”

多通道技術提高分析通量

為了進一步提高分析通量，實驗室裝備兩套具有先進的多通道技術的 TLX-2系統。TLX-2系統可獲得兩臺獨立液質（LC/MS）系統與一臺質譜儀聯用的分析通量。當遇到時間很緊急的項目或者樣品量很大的項目時，McDougall 和 Blackburn就要依靠該系統提高分析通量。他們曾使用該系統運行32?000個樣品研究唑吡坦（安必恩）的新分子式。

“假如沒有TLX-2系統，我們不可能及時獲得安必恩的分析數據。”McDougall說道。

最近，該小組經常接到在幾天內完成1000個樣品分析的任務。其他實驗室對于此類任務可能會難以應付。而賽諾菲-安萬特研究團隊卻可以信心十足地完成項目，因為他們擁有可靠的系統、適用性好的分析方法以及24小時的運行能力。

“我們已經使用TLX系統十多年，對系統有了一個全面的了解，”McDougall說，“我們當時投資從賽默飛世爾科技公司獲得一套全面的解決方案，現在我們一直受益于當時的決定。”

FAIMS解決干擾問題

在2008年的一次常規藥物分析中，賽諾菲-安萬特團隊發現了某項研究的特定干擾峰，后來確認該干擾峰為克他命，一種廣泛使用的動物止痛藥。當干擾峰與目標藥物在色譜中分開時，又對內標物產生干擾。McDougall 和 Blackburn擔心該干擾物會改變內標峰面積，從而影響定量分析。更重要的是，美國食品藥品監督局（FDA）可能會由于結果重現性不佳而駁回研究數據。

“生物分析實驗必須嚴格遵守FDA的規定。”McDougall說，“我確信如果提交給FDA審查的話，肯定會因為結果重現性不佳而被駁回，所以我們必須加以改進。”當然他們可以通過提高藥物的容量因子去解決色譜干擾問題，但這意味著需要重新進行完整的分析方法確認，這一過程需要花費大量寶貴時間。

McDougall 和 Blackburn選擇了采用Thermo Scientific FAIMS技術解決問題。該技術為化合物分離增加了一個新的維度，提供更好的特異性和分析方法適用性。FAIMS技術通過發掘離子形狀、電荷以及尺寸方面的區別消除干擾。該分離過程發生在離子化后的氣相狀態。為了采用FAIMS技術分離干擾峰，McDougall和Blackburn只需在目標化合物溶液中加入內標化合物和干擾物克他命，然后在FAIMS單元中優化補償電壓（CV）。由于干擾物克他命與候選藥物化合物的FAIMS電壓不同，系統可輕松實現二者的分離。

“FAIMS技術為您的分析方法增加了另一個維度的特異性，” McDougall說，“您可以依靠液相色譜實現分離，通過不同質荷比實現分離。現在您還可以采用FAIMS技術根據分子尺寸、形狀以及電荷的不同實現分離，這是一個相當簡潔而有效的方法。”

圖2.  分析目標物的典型LC-FAIMS-MS/MS 色譜圖。分析對象為血漿中LLOQ濃度水平的目標物，CV = -13.9V。LC流速在柱后分流為0.5ml/min。

十多年來，該研究團隊一直在使用基于LC-MS/MS系統的TurboFlow方法，因此不希望放棄全自動在線樣品制備方法。FAIMS技術利用全新的硬件解決方案將選擇性提高了一個水平，并實現與TurboFlow方法的無縫連接。

該研究團隊初步嘗試使用FAIMS技術后，現在又面臨新的挑戰。他們需要開發一種方法，用于分析分子量約為6000Da的多肽生物藥物。

傳統方法是采用酶聯接免疫吸附劑測定方法（ELISA）測量化合物，但該方法的特異性令人擔憂，這是ELISA方法的一個主要缺點。因此，該研究團隊決定使用LC-MS/MS、TurboFlow方法以及FAIMS技術進行物理化學分離。

為了實現低濃度樣品的定量分析，傳統方法就是增加樣品體積，提取更多樣品，然后富集樣品進行分析。但是，為了滿足定量限要求，所需的大量生物基質來之不易。最終，采用一種組合方法，將免疫親和萃取與TurboFlow方法、LC、FAIMS技術以及MS/MS技術相結合，提供了最佳分析結果。

“實際上我們已經別無選擇，” McDougall說，“我們需要一種可以改進信噪比，但無需使用大量生物基質的分析方法。這些化合物具有不同電荷狀態，因此可以實現相互分離。我們必須利用一切技術手段獲得所需的靈敏度。”

FAIMS單元能夠24小時全天候工作，為亞倫維克研究團隊提供可靠而耐用的分析工具。

圖1a上圖顯示分析目標物在保留時間1.78min處有色譜峰，信噪比（S/N）為4，具有很嚴重的化學背景；圖1b：下圖顯示內標在與目標物相同的保留時間出峰，在保留時間為2.01min處有一干擾峰，致使內標峰面積積分受到干擾峰的影響。

“FAIMS會提供我們所需的選擇性，這一點我們非常有信心。但實際上，即使在生產環境下運行FAIMS單元，也能確保可靠的樣品分析。” McDougall說，“FAIMS技術在實際生產環境下體現出強大的適用性。”

“選擇性越好，分析方法就越可靠，精密度、精確性就越好，方法適用性越好，干擾物質的影響就越小。”McDougall說，“無論來自基質或合并用藥，任何干擾物質均受到美國食品藥品監督局（FDA）的關注。如果您可以消除所有干擾的影響，即使當您開發分析方法時沒有出現明顯的干擾，這意味著這種分析方法在生產環境中具有相當好的適用性。”

為了追求更好的選擇性，開發更好的分析方法，賽諾菲-安萬特藥物公司在全球的所有實驗室已經采用了亞倫維克實驗室的工作流程，包括Thermo Scientific質譜儀、TLX系統與FAIMS技術。

圖2a顯示信噪比(S/N)為7949，該值是沒有采用FAIMS技術的實驗信噪比的2000倍。FAIMS技術的離子傳輸效率（%）為標準LC-MS實驗的4.5倍。圖2b顯示沒有干擾的內標色譜峰。

小結

賽諾菲-安萬特研究團隊將具有TurboFlow在線樣品前處理技術和先進的多通道技術的TLX系統與FAIMS技術相結合，表現出極高水平的選擇性。這一優點對藥物分析方法開發至關重要。這些互補性的解決方案幫助實驗室不僅滿足精確性和精密度這兩個首要考察因素，同時還獲得了高通量、分析方法適用性好等附加優勢。