三聚氰胺摻假蛋白食品的篩選

本文提供了一種分析三聚氰胺及其類似物的耐用、有效且確定性方案。除優化的GC/MS方法外，還討論了樣品準備方案，包括提取和衍生等。

三聚氰胺是一種富含氮工業化學品，有多種用途，最常見的是用于制造三聚氰胺樹脂——一種非常耐用的聚合物。在2007年春季北美地區，自從有報道表明出現在小麥麩質中的三聚氰胺可能引起寵物貓和狗的腎衰竭之后［1］，三聚氰胺這一名字很快被人們所知。進一步的研究結果令科學家們相信就是這些三聚氰胺及其類似物——三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺及三聚氰酸綜合導致寵物生病［2］。為完成對寵物飼料原材料的調查，需要測定三聚氰胺是否被故意添加至小麥麩質假冒蛋白質以提高蛋白檢測含量。因為工業標準的蛋白含量測試僅僅通過氮含量測試推斷蛋白含量，而三聚氰胺正好是一個廉價的含氮豐富的原料，如果采用定氮方式測量蛋白含量，添加三聚氰胺蛋白含量的測試結果就會顯著增加。

對三聚氰胺摻假蛋白的關注很自然會延伸到對各種不同類型干蛋白粉原料的關注，無論這些干蛋白粉是作為動物飼料還是人類食品原料。顯著的事實和潛在的公眾健康危害性促使美國食品藥監局（FDA）迅速發行關于蛋白原料中三聚氰胺分析的標準測試方法。此方法命名為：“GC/MS方法篩查三聚氰胺、三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺及三聚氰酸”［3］，它與定氮法測試蛋白含量相結合確定原材料是否確實富含蛋白質，還是含有其他非蛋白質氮元素。一旦檢出產品中含有任何三聚氰胺或其類似物，此產品即刻標示為摻假物不允許非法出售。美國食品藥監局（FDA）目前的分析方法僅涉及對三聚氰胺及其類似物的定性判斷和半定量估算。

實驗部分
整個實驗包括三個主要部分：提取、衍生和GC/MS分析，這些方法嚴格參考μS.FDA出版發行的測試方法。

從干燥蛋白質原料中提取三聚氰胺相對比較簡單，取0.5g樣品置于20ml按10:40:50體積比制成的二乙胺（DEA）、水和乙腈混合溶液中超聲提取30min。超聲提取后置于3500r/min下離心10min，以去除樣品基質中細顆粒物，懸浮液通過0.45μm PTFE濾膜過濾，PTFE作為首選材料是因為食品類型基質中的很多化合物容易被其他材料濾膜吸附。經濾膜過濾后，取200μl溶液在70℃溫度置于干燥清潔氮氣氣流下干燥蒸發，干燥之后的樣品等待衍生化處理。

干燥的樣品置于自動進樣器小瓶里，加入200μl吡啶和100μl濃度為0.5μg/ml的內標溶液。三聚氰胺和相關化合物被衍生化試劑Sylon-BFT(Sμpelco)轉化為三甲基硅（TMS）衍生物，衍生試劑Sylon-BFT由含1%TMCS(三甲基氯硅烷)的BSTFA(雙三甲基硅三氟乙酰胺)組成，添加200μl此溶液至樣品溶液中，70℃下保溫45min。衍生化重要的一點需要注意的是要考慮到樣品的基質如何很好的與試劑進行反應。如果衍生化樣品基質富含氨基酸，那么有必要加入少量樣品或者更多的試劑進行反應，以補償氨基酸對Sylon-BFT的消耗，還可能需要進行一些條件性實驗。內標物（ISTD）為2,6-二氨基-4-氯嘧啶（DACP），用于監測衍生化過程，糟糕的內標回收率預示著衍生化反應進行的不夠完全，很有可能是由殘留的水或活性基質引起的。

本文采用的GC/MS系統是Perkin Elmer Clarus 500 GC/MS，儀器設置的參數總結于表1和表2。GC采用可程序升溫的分流/不分流進樣口，280℃恒溫。襯管采用2mm內徑的，進樣體積為0.5μl，與溶劑在進樣口襯管內膨脹體積相匹配，更大體積的進樣量將導致溶劑由襯管中膨脹溢出，若溶劑膨脹體積超過襯管容積，色譜峰形會變差。

本文采用的優化的儀器分析條件用于分析大米蛋白中的三聚氰胺，在這個分析案例中，有必要延長GC柱溫箱程序以便于將三聚氰酸二酰胺和三聚氰胺從樣品基質峰中分離出來。根據樣品基質復雜程度的變化，可能需要修改GC分析條件以達到分析物與干擾基質之間的分離，達到更好分離效果的修正方法必須基于每種不同的基質。匹配不同基質分離的最好技術是將空白加標與樣品加標對比。如果樣品基質中的雜質峰流出時間不同于分析物的保留時間，就不需要對方法進行修改。當然，如果存在樣品基質峰與目標分析物共流出現象，就需要對GC柱溫升溫條件進行修改以達到更好的分離。

在這個方法中，MS掃描質量范圍為50~450μ，全掃描方式采集質譜數據。質譜數據幫助所有分析物的定性確認。傳輸線和離子源的溫度分別設為280℃和230℃。將扣除了背景的高濃度標準品分析的質譜圖作為化合物定性的參考。

結果

如前所述，一旦檢測到三聚氰胺或其類似物就表明該產品為摻假品，不得作為食品或食品添加劑非法出售。由于對食品行業存在潛在的經濟影響，對人與動物的健康存在潛在威脅，測試數據必須有嚴格的質量控制（QC）以確保結果的準確性。除了高低濃度水平的標準樣品測試，此方案的質量控制還包括溶劑空白、方法空白和樣品加標：溶劑空白指嘧啶溶劑分析和衍生化試劑分析；方法空白指不加標樣品經過提取過程后分析；樣品加標包括低濃度和高濃度加標。盡管這是一個過與不過篩選式方案，仍然需要在樣品批量分析前和后進行低濃度（0.1μg/ml）和高濃度(1.0μg/ml)校準樣分析用于確定半定量分析結果。圖1為低濃度標樣分析的色譜圖。從圖中可見，即使是低濃度水平，分析物響應仍然很顯著——GC/MS能夠提供足夠的靈敏度。

正如在實驗描述部分討論的，樣品基質在進行摻假蛋白分析時會遇到非常廣泛的干擾，因此必須修改GC柱溫箱升溫程序將三聚氰胺及相關目標化合物與干擾基質峰分離開來。另外一個降低基質影響的辦法是提取少量樣品。提取少量樣品可以降低樣品基質中高沸點化合物對GC/MS系統的影響。由于樣品量減少，勢必需要提高GC/MS的靈敏度來檢測低濃度水平樣品。SIFI（選擇離子掃描與全掃描）是一種MS數據采集方式，在此模式下，全掃描與選擇離子掃描同時進行，這樣不僅可以達到最大的靈敏度，還保持了全掃描數據的采集。本方法中全掃描方式已經提供足夠的靈敏度，但是某些情況下可能需要更高的靈敏度，SIFI就能滿足。

本方法不僅分析了標準樣品和質量控制樣品，還分析了大量蛋白質原料樣。圖2是一張大米蛋白樣品的分析圖，其中摻假物呈現高濃度水平。在這個樣品中存在很高濃度的污染，正好體現了之前討論的質量控制程序的有效性。內標化合物DACP驗證了衍生化反應已經進行完全，樣品中DACP的峰面積與標準樣中DACP峰面積相當。在這個分析案例中，標準樣中DACP的平均峰面積為643，161，樣品中DACP平均峰面積為646，585，表明衍生化反應已經進行完全。

在圖2中該樣品污染到色譜柱容量過載的程度，色譜柱容量過載可通過拖尾的色譜峰和及三聚氰酸與三聚氰酸一酰胺漂移的保留時間看出。此外，此樣品需要重新進行提取分析，而且只能提取更少量樣品是因為目標分析物的響應也超出了低濃度和高濃度的標樣響應范圍。相比其他目標類似物和樣品基質三聚氰胺被檢測出很低濃度水平，GC的方法進行優化之后，三聚氰胺的峰可以完全從周圍干擾峰中分離出來，易于辨認。加上與標準譜圖的對照，可以幫助三聚氰胺的定性。圖3顯示了三聚氰胺標樣質譜圖與樣品分析質譜圖的對比，質譜圖和保留時間都非常匹配。

結論

全世界范圍內有大量蛋白原料被用于食品和飼料，而最近三聚氰胺及其類似物摻假蛋白促使了對蛋白食品和飼料成分更詳細分析測試的需要。這個分析是非常重要的，它可以檢測到一些通用的摻假物，與總氮測試相結合可以驗證食品產品中真實的蛋白含量。

本文闡述了基于新出版的μ.S.FDA方法建立的三聚氰胺及其類似物的分析方案，包括樣品前處理和儀器分析技術。樣品前處理包括溶劑萃取和衍生化，內標化合物作為基質衍生化過程指示劑驗證衍生化反應是否進行完全。GC/MS分析是一種半定量篩選方法，低濃度和高濃度標樣支持樣品分析。除標樣分析外，多次空白和基質加標分析用于整個測試的質量控制。Clarus GC/MS系統可在全掃描模式下檢測到低濃度加標摻假物，意味著可達到日常復雜樣品基體篩選分析要求的預期靈敏度。

【參考文獻】

[1] http://www.fda.gov/cvm/MenμFoodRecallFAQ.htm

[2] Barboza, David, “Another Chemical Emerges in Pet Food Case”, New York Times, May 9, 2007.

[3] http://www.fda.gov/cvm/MelaminePresence.htm