生化實驗講義(理論部分)——層析技術（四）

5. 正相色譜與反相色譜
  正相色譜是指固定相的極性高于流動相的極性，因此，在這種層析過程中非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動的速度快，先從柱中流出來。
  反相色譜是指固定相的極性低于流動相的極性，在這種層析過程中，極性大的分子比極性小的分子移動的速度快而先從柱中流出。
  一般來說，分離純化極性大的分子（帶電離子等）采用正相色譜（或正相柱），而分離純化極性小的有機分子（有機酸、醇、酚等）多采用反相色譜（或反相柱）。
  6. 操作容量（或交換容量）
  在一定條件下，某種組分與基質（固定相）反應達到平衡時，存在于基質上的飽和容量，我們稱為操作容量（或交換容量）。它的單位是毫摩爾（或毫克）/克（基質）或毫摩爾（或毫克）/毫升（基質），數值越大，表明基質對該物質的親合力越強。應當注意，同一種基質對不同種類分子的操作容量是不相同的，這主要是由于分子大小（空間效應）、帶電荷的多少、溶劑的性質等多種因素的影響。因此，實際操作時，加入的樣品量要盡量少些，特別是生物大分子，樣品的加入量更要進行控制，否則用層析辦法不能得到有效的分離。
  3.1.4 層析法的分類
  層析根據不同的標準可以分為多種類型:
  1. 根據固定相基質的形式分類，層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。紙層析是指以濾紙作為基質的層析。薄層層析是將基質在玻璃或塑料等光滑表面鋪成一薄層，在薄層上進行層析。柱層析則是指將基質填裝在管中形成柱形，在柱中進行層析。紙層析和薄層層析主要適用于小分子物質的快速檢測分析和少量分離制備，通常為一次性使用，而柱層析是常用的層析形式，適用于樣品分析、分離。生物化學中常用的凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式。
  2. 根據流動相的形式分類，層析可以分為液相層析和氣相層析。氣相層析是指流動相為氣體的層析，而液相層析指流動相為液體的層析。氣相層析測定樣品時需要氣化，大大限制了其在生化領域的應用，主要用于氨基酸、核酸、糖類、脂肪酸等小分子的分析鑒定。而液相層析是生物領域最常用的層析形式，適于生物樣品的分析、分離。
  3. 根據分離的原理不同分類，層析主要可以分為吸附層析、分配層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等。
  吸附層析是以吸附劑為固定相，根據待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達到分離目的的一種層析技術。
  分配層析是根據在一個有兩相同時存在的溶劑系統中，不同物質的分配系數不同而達到分離目的的一種層析技術。
  凝膠過濾層析是以具有網狀結構的凝膠顆粒作為固定相，根據物質的分子大小進行分離的一種層析技術。
  離子交換層析是以離子交換劑為固定相，根據物質的帶電性質不同而進行分離的一種層析技術。
  親和層析是根據生物大分子和配體之間的特異性親和力（如酶和抑制劑、抗體和抗原、激素和受體等），將某種配體連接在載體上作為固定相，而對能與配體特異性結合的生物大分子進行分離的一種層析技術。親和層析是分離生物大分子最為有效的層析技術，具有很高分辨率。
  3.1.5 柱層析的基本裝置及基本操作
  目前，最常用的層析類型是各種柱層析，下面就簡述柱層析的基本裝置及操作方法，薄層層析的裝置和操作將在后面詳細討論。
  1. 柱層析的基本裝置
  2. 柱層析的基本操作
  柱層析的基本操作包括以下一些步驟：
  ⑴ 裝柱
  柱子裝的質量好與差，是柱層析法能否成功分離純化物質的關鍵步驟之一。一般要求柱子裝的要均勻，不能分層，柱子中不能有氣泡等。否則要重新裝柱。
  首先選好柱子，根據層析的基質和分離目的而定。一般柱子的直徑與長度比為1:10~50；凝膠柱可以選1:100~200，同時將柱子洗滌干凈。
  將層析用的基質（如吸附劑、樹脂、凝膠等）在適當的溶劑或緩沖液中溶脹，并用適當濃度的酸（0.5N~1N）、堿 （0.5N~1N）、鹽（0.5M~1M）溶液洗滌處理，以除去其表面可能吸附的雜質。然后用去離子水（或蒸餾水）洗滌干凈并真空抽氣（吸附劑等與溶液混合在一起），以除去其內部的氣泡。
關閉層析柱出水口，并裝入1/3柱高的緩沖液，并將處理好的吸附劑等緩慢地倒入柱中，使其沉降約3cm高。
打開出水口，控制適當流速，使吸附劑等均勻沉降，并不斷加入吸附劑溶液。（吸附劑的多少根據分離樣品的多少而定。）注意不能干柱、分層，否則必須重新裝柱。
  最后使柱中基質表面平坦并在表面上留有2~3cm高的緩沖液，同時關閉出水口。（采用機械化裝柱法在此省略。）
  ⑵ 平衡
  柱子裝好后，要用所需的緩沖液（有一定的pH和離子強度）平衡柱子。用恒流泵在恒定壓力下走柱子（平衡與洗脫時的壓力盡可能保持相同）。平衡液體積一般為3~5倍柱床體積，以保證平衡后柱床體積穩定及基質充分平衡。如果需要，可用蘭色葡聚糖2000在恒壓下走柱，如色帶均勻下降，則說明柱子是均勻的。有時柱子平衡好后，還要進行轉型處理。這方面的內容在離子交換層析中加以介紹。
  ⑶ 加樣
  加樣量的多少直接影響分離的效果。一般講，加樣量盡量少些，分離效果比較好。通常加樣量應少于20%的操作容量，體積應低于5%的床體積，對于分析性柱層析，一般不超過床體積的1%。當然，最大加樣量必須在具體條件下多次試驗后才能決定。
  應注意的是，加樣時應緩慢小心地將樣品溶液加到固定相表面，盡量避免沖擊基質，以保持基質表面平坦。詳細操作見層析實驗。
  ⑷ 洗脫
  當我們選定好洗脫液后，洗脫的方式可分為簡單洗脫、分步洗脫和梯度洗脫三種。
  簡單洗脫：柱子始終用同樣的一種溶劑洗脫，直到層析分離過程結束為止。如果被分離物質對固定相的親合力差異不大，其區帶的洗脫時間間隔（或洗脫體積間隔）也不長，采用這種方法是適宜的。但選擇的溶劑必須很合適方能使各組分的分配系數較大。否則應采用下面的方法。
  分步洗脫：這種方法按照遞增洗脫能力順序排列的幾種洗脫液，進行逐級洗脫。它主要對混合物組成簡單、各組分性質差異較大或需快速分離時適用。每次用一種洗脫液將其中一種組分快速洗脫下來。
  梯度洗脫：當混合物中組分復雜且性質差異較小時，一般采用梯度洗脫。它的洗脫能力是逐步連續增加的，梯度可以指濃度、極性、離子強度或pH值等。最常用的是濃度梯度。在水溶液中，亦即離子強度梯度。可形成梯度的形式有三種。
  洗脫條件的選擇，也是影響層析效果的重要因素。當對所分離的混合物的性質了解較少時，一般先采用線性梯度洗脫的方式去嘗試，但梯度的斜率要小一些，盡管洗脫時間較長，但對性質相近的組分分離更為有利。同時還應注意洗脫時的速率。前面我們已經談到，流速的快慢將影響理論塔板高度，從而影響分辨率。事實上，速度太快，各組分在固液兩相中平衡時間短，相互分不開，仍以混合組分流出。速度太慢，將增大物質的擴散，同樣達不到理想的分離效果。只有多次試驗才會得到合適的流速。總之，我們必須經過反復的試驗與調整（可以用正交試驗或優選法），才能得到最佳的洗脫條件。還應強調的一點是，在整個洗脫過程中，千萬不能干柱，否則分離純化將會前功盡棄。
  ⑸ 收集、鑒定及保存
  在生化實驗中，基本上我們都是采用部分收集器來收集分離純化的樣品。由于檢測系統的分辨率有限，洗脫峰不一定能代表一個純凈的組分。因此，每管的收集量不能太多，一般1ml-5ml / 管。如果分離的物質性質很相近，可低至0.5ml / 管。這視具體情況而定。在合并一個峰的各管溶液之前，還要進行鑒定。例如，一個蛋白峰的各管溶液，我們要先用電泳法對各管進行鑒定。對于是單條帶的，認為已達電泳純，合并在一起。其他的另行處理。對于不同種類的物質采用相應的鑒定方法，在這里不再敘述。最后，為了保持所得產品的穩定性與生物活性，我們一般采用透析除鹽、超濾或減壓薄膜濃縮，再冰凍干燥，得到干粉，在低溫下保存備用。
  ⑹ 基質（吸附劑、交換樹脂或凝膠等）的再生
  許多基質（吸附劑、交換樹脂或凝膠等）可以反復使用多次，而且價格昂貴，所以層析后要回收處理，以備再用，嚴禁亂倒亂扔。這也是一個科研工作者的科學作風問題。各種基質的再生方法可參閱具體層析實驗及有關文獻。
  3.2 凝膠層析
  3.2.1 簡介
  凝膠層析（gel chromatography）又稱為凝膠排阻層析（gel exclusion chromatography）、分子篩層析（molecular sieve chromatography）、凝膠過濾（gel filtration）、凝膠滲透層析（gel permeation chromatography）等。它是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小順序分離樣品中各個組分的液相色譜方法。1959年，Porath和Flodin首次用一種多孔聚合物－交聯葡聚糖凝膠作為柱填料，分離水溶液中不同分子量的樣品，稱為凝膠過濾。1964年，Moore制備了具有不同孔徑的交聯聚苯乙烯凝膠，能夠進行有機溶劑中的分離，稱為凝膠滲透層析（流動相為有機溶劑的凝膠層析一般稱為凝膠滲透層析）。隨后這一技術得到不斷的完善和發展，目前廣泛的應用于生物化學、高分子化學等很多領域。
  凝膠層析是生物化學中一種常用的分離手段，它具有設備簡單、操作方便、樣品回收率高、實驗重復性好、特別是不改變樣品生物學活性等優點，因此廣泛用于蛋白質（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分離純化，同時還應用于蛋白質分子量的測定、脫鹽、樣品濃縮等。
  3.2.2 凝膠層析的基本原理
  凝膠層析是依據分子大小這一物理性質進行分離純化的。凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內部具有立體網狀結構，形成很多孔穴。當含有不同分子大小的組分的樣品進入凝膠層析柱后，各個組分就向固定相的孔穴內擴散，組分的擴散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。比孔穴孔徑大的分子不能擴散到孔穴內部，完全被排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間隨流動相向下流動，它們經歷的流程短，流動速度快，所以首先流出；而較小的分子則可以完全滲透進入凝膠顆粒內部，經歷的流程長，流動速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之間的分子在流動中部分滲透，滲透的程度取決于它們分子的大小，所以它們流出的時間介于二者之間，分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。這樣樣品經過凝膠層析后，各個組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達到了分離的目的。
  1. 外水體積、內水體積、基質體積、柱床體積、洗脫體積
  外水體積是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，也就是凝膠顆粒間液體流動相的體積。內水體積是指凝膠顆粒中孔穴的體積，凝膠層析中固定相體積就是指內水體積。基質體積是指凝膠顆粒實際骨架體積。而柱床體積就是指凝膠柱所能容納的總體積。洗脫體積是指將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積。我們設柱床體積為Vt，外水體積為Vo，內水體積為Vi，基質體積為Vg，則有：
      Vt＝Vo＋Vi＋Vg     
  由于Vg相對很小，可以忽略不計，則有：
      Vt＝Vo＋Vi  
  設洗脫體積為Ve，Ve一般是介于Vo 和Vt之間的。對于完全排阻的大分子，由于其不進入凝膠顆粒內部，而只存在于流動相中，故其洗脫體積Ve＝Vo；對于完全滲透的小分子，由于它可以存在于凝膠柱整個體積內（忽略凝膠本身體積Vg），故其洗脫體積Ve＝Vt。分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。有時可能會出現Ve ? Vt，這是由于這種分子與凝膠有吸附作用造成的。