生化實驗講義(理論部分)——層析技術（十）

配體與基質偶聯后，通常要測定配體的結合量以了解其與基質的偶聯情況，同時也可以推斷親和層析過程中對待分離的生物大分子吸附容量。配體結合量通常是用每毫升或每克基質結合的配體的量來表示。測定配體結合量的方法很多，下面簡單介紹幾種：

1) 差量分析：根據加入配體的總量減去配體與基質偶聯后洗滌出來的量即可大致推算出配體的結合量。當配體可以用光譜法準確定量時，這種方法還是相當準確的。

2) 直接光譜測量：對于能夠吸收250nm以上波長的配體，可以直接用光譜法測定與基質結合的配體的量。

3) 凝膠溶解：通過適當的方法將凝膠溶解，如75?C下與酸或堿作用，而后直接用光譜法測量。

4) 酸或酶的水解：用酸或酶作用，使得基質釋放出配體或配體的裂解物進行分析。

5) 2,4,6－三硝基苯磺酸鈉（TNBS）分析：利用TNBS與未結合配體和結合某些配體的基質作用呈現不同的顏色，可以計算出配體結合量

6) 元素分析：如果配體中含有某種特別的元素，通過元素分析就可以確定配體結合量。

7) 放射性分析法：偶聯中加入一定量帶有同位素的配體，通過放射性分析確定配體結合量，這是一種非常靈敏的方法。

影響配體結合量的因素很多，包括基質和配體的性質、基質的活化方法及條件、基質和配體偶聯反應的條件等等。例如通常溴化氰活化的基質的活性基團比環氧基活化的基質多，配體結合量可能較大。在用溴化氰活化時，增加溴化氰的量及反應的pH，可以增加基質上活化基團的量，從而增大配體結合量。偶聯過程中增加配體的量及增大反應的pH，也可以增大配體結合量。實驗中通常希望配體結合量較高，但應注意增加配體結合量應根據實際情況，還要考慮到其它因素的影響。因為提高配體的結合量不等價于提高親和吸附劑的吸附容量，配體結合量只是影響親和吸附劑吸附容量的一個因素，還有很多因素，如基質、配體以及待分離物質本身的性質，配體在基質的結合情況以及后面要介紹的實驗操作條件等都可能對親和吸附劑的吸附容量產生很大的影響。例如增大配體的結合量通常可以增加吸附容量，但有些增大配體結合量的條件可能會影響配體的結構，降低配體和待分離物質的親和力，這樣反而會降低親和吸附劑的吸附容量。實際影響親和吸附劑吸附容量的因素是非常復雜的，各種因素的影響都不是絕對的，要獲得較高的吸附容量往往要考慮很多因素，并通過實驗摸索來選擇合適的條件。

目前已有多種活化的基質以及偶聯各種配體的親和吸附劑制成商品出售，可以省去基質活化，配體偶聯等復雜的步驟。使用方便，效果好，但一般價格昂貴。關于這些產品的具體情況，可參閱本書后面的參考文獻或相關的產品介紹。

3. 親和吸附劑的再生和保存

親和吸附劑的再生就是指使用過的親和吸附劑，通過適當的方法使去除吸附在其基質和配體（主要是配體）上結合的雜質，使親和吸附劑恢復親和吸附能力。一般情況下，使用過的親和層析柱，用大量的洗脫液或較高濃度的鹽溶液洗滌，再用平衡液重新平衡即可再次使用。但在一些情況下，尤其是當待分離樣品組分比較復雜的時候，親和吸附劑可能會產生較嚴重的不可逆吸附，使親和吸附劑的吸附效率明顯下降。這時需要使用一些比較強烈的處理手段，使用高濃度的鹽溶液、尿素等變性劑或加入適當的非專一性蛋白酶。但如果配體是蛋白質等一些易于變性的物質，則應注意處理時不能改變配體的活性。

親和吸附劑的保存一般是加入0.01%的疊氮化鈉，4?C下保存。也可以加入0.5%的醋酸洗必泰或0.05%的苯甲酸。應注意不要使親和吸附劑冰凍。

3.4.4 親和層析的基本操作

親和吸附劑選擇制備后，親和層析的其它操作與一般的柱層析基本類似。下面主要介紹親和層析過程中的一些注意事項。

1. 上樣
   

親和層析純化生物大分子通常采用柱層析的方法。親和層析柱一般很短，通常10cm左右。上樣時應注意選擇適當的條件，包括上樣流速、緩沖液種類、pH、離子強度、溫度等，以使待分離的物質能夠充分結合在親和吸附劑上。

一般生物大分子和配體之間達到平衡的速度很慢，所以樣品液的濃度不易過高，上樣時流速應比較慢，以保證樣品和親和吸附劑有充分的接觸時間進行吸附。特別是當配體和待分離的生物大分子的親和力比較小或樣品濃度較高、雜質較多時，可以在上樣后停止流動，讓樣品在層析柱中反應一段時間，或者將上樣后流出液進行二次上樣，以增加吸附量。樣品緩沖液的選擇也是要使待分離的生物大分子與配體有較強的親和力。另外樣品緩沖液中一般有一定的的離子強度，以減小基質、配體與樣品其它組分之間的非特異性吸附。

生物分子間的親和力是受溫度影響的，通常親和力隨溫度的升高而下降。所以在上樣時可以選擇適當較低的溫度，使待分離的物質與配體有較大的親和力，能夠充分的結合；而在后面的洗脫過程可以選擇適當較高的溫度，使待分離的物質與配體的親和力下降，以便于將待分離的物質從配體上洗脫下來。

上樣后用平衡洗脫液洗去未吸附在親和吸附劑上的雜質。平衡緩沖液的流速可以快一些，但如果待分離物質與配體結合較弱，平衡緩沖液的流速還是較慢為宜。如果存在較強的非特異性吸附，可以用適當較高離子強度的平衡緩沖液進行洗滌，但應注意平衡緩沖液不應對待分離物質與配體的結合有明顯影響，以免將待分離物質同時洗下。

2. 洗脫

親和層析的另一個重要的步驟就是要選擇合適的條件使待分離物質與配體分開而被洗脫出來。親和層析的洗脫方法可以分為兩種：特異性洗脫和非特異性洗脫。

⑴ 特異性洗脫

特異性洗脫是指利用洗脫液中的物質與待分離物質或與配體的親和特性而將待分離物質從親和吸附劑上洗脫下來。

特異性洗脫也可以分為兩種：一種是選擇與配體有親和力的物質進行洗脫，另一種是選擇與待分離物質有親和力的物質進行洗脫。前者在洗脫時，選擇一種和配體親和力較強的物質加入洗脫液，這種物質與待分離物質競爭對配體的結合，在適當的條件下，如這種物質與配體的親和力強或濃度較大，配體就會基本被這種物質占據，原來與配體結合的待分離物質被取代而脫離配體，從而被洗脫下來。例如用凝集素作為配體分離糖蛋白時，可以用適當的單糖洗脫，單糖與糖蛋白競爭對凝集素的結合，可以將糖蛋白從凝集素上置換下來。后一種方法洗脫時，選擇一種與待分離物質有較強親和力的物質加入洗脫液，這種物質與配體競爭對待分離物質的結合，在在適當的條件下，如這種物質與待分離物質的親和力強或濃度較大，待分離物質就會基本被這種物質結合而脫離配體，從而被洗脫下來。例如用染料作為配體分離脫氫酶時，可以選擇NAD+進行洗脫，NAD+是脫氫酶的輔酶，它與脫氫酶的親和力要強于染料，所以脫氫酶就會與NAD+結合而從配體上脫離。特異性洗脫方法的優點是特異性強，可以進一步消除非特異性吸附的影響，從而得到較高的分辨率。另外對于待分離物質與配體親和力很強的情況，使用非特異性洗脫方法需要較強烈的洗脫條件，很可能使蛋白質等生物大分子變性，有時甚至只能使待分離的生物大分子變性才能夠洗脫下來，使用特異性洗脫則可以避免這種情況。由于親和吸附達到平衡比較慢，所以特異性洗脫往往需要較常的時間和較大的洗脫條件，可以通過適當的改變其它條件，如選擇親和力強的物質洗脫、加大洗脫液濃度等等，來縮小洗脫時間和洗脫體積。

⑵ 非特異性洗脫

非特異性洗脫是指通過改變洗脫緩沖液pH、離子強度、溫度等條件，降低待分離物質與配體的親和力而將待分離物質洗脫下來。

當待分離物質與配體親和力較小時，一般通過連續大體積平衡緩沖液沖洗，就可以在雜質之后將待分離物質洗脫下來，這種洗脫方式簡單、條件溫和，不會影響待分離物質的活性。但洗脫體積一般比較大，得到的待分離物質濃度較低。當待分離物質和配體結合較強時，可以通過選擇適當的pH、離子強度等條件降低待分離物質與配體的親和力，具體的條件需要在實驗中摸索。可以選擇梯度洗脫方式，這樣可能將親和力不同的物質分開。如果希望得到較高濃度的待分離物質，可以選擇酸性或堿性洗脫液，或較高的離子強度一次快速洗脫，這樣在較小的洗脫體積內就能將待分離物質洗脫出來。但選擇洗脫液的pH、離子強度時應注意盡量不影響待分離物質的活性，而且洗脫后應注意中和酸堿，透析去除離子，以免待分離物質喪失活性。對于待分離物質與配體結合非常牢固時，可以使用較強的酸、堿或在洗脫液中加入脲、胍等變性劑使蛋白質等待分離物質變性，而從配體上解離出來。然后再通過適當的方法使待分離物質恢復活性。