膜蛋白的結構形成過程研究

1）膜蛋白的結構形成過程研究

成孔毒素（Pore-forming toxin, PFT）能在靶細胞膜上寡聚化形成穿膜通道, 破壞細胞膜結構并使其滲透性增強而導致細胞滲透性溶解。 PFT寡聚體在細胞膜上可以連接形成密排六方結構（hcp）。

Lysenin是來源于蚯蚓的一種PFT，可在鞘磷脂/膽固醇（SM/chol）雙層膜結構中寡聚化并形成hcp。實驗中，研究人員使用了日本RIBM的超高速視頻級原子力顯微鏡（HS-AFM），對SM/chol雙層膜結構中lysenin寡聚體組裝成hcp的動態過程進行了實時成像，發現了hcp結構形成的規律。

研究人員將lysenin與SM/chol雙層膜結構在云母為基底的環境下共同培養后使用HS-AFM進行成像。下圖顯示了lysenin寡聚體形成的hcp在膜結構上的分布。白色六邊形表示一個hcp單元，箭頭表示未完全形成的寡聚體。通過計算可以獲得Hcp單元的間距和寡聚體直徑等數據，與之前使用電鏡的研究獲得的數據一致。

通過HS-AFM還可以獲得lysenin寡聚體的三維圖像。對各個寡聚體的高度數據進行統計，可以發現高度分布主要為兩種，高度較低的寡聚體已經嵌入了膜結構中，并可能形成了核孔。

接下來研究人員對400×300nm區域內的SM/chol雙層膜結構上的lysenin組裝過程進行了動態成像。圖A展示了lysenin簇的形成并可以檢測簇的增長方向（圖B），最終組裝形成hcp結構。 

在黑色的云母基底上也能觀察到lysenin，分析雙層膜結構上和基底上的lysenin半徑大小可以得出，雙層膜結構上的lysenin形成了寡聚體進而組成hcp結構，而基底上的lysenin處于單體或不規則聚集形態，無法形成寡聚體，這也與之前的研究結果一致。

對視野內的lysenin簇如B圖進行劃分并進一步分析可以得出：

1. Lysenin形成單個簇后，在雙層膜上水平擴散，聚集排列形成hcp結構；

2. 新形成的簇會組成新的矩形排列（彩色矩形）或填充到已有的矩形排列的空缺處，有些已經形成的簇會在膜上擴散或分解；

3. 矩形排列的方向可變（如最上方紅色矩形）；

4. 絕大多數Lysenin簇在裝配開始就會聚集形成簇，而不是隨機分布在膜上。

HS-AFM還可以在更高的放大倍數下以更高速率成像，以實現對lysenin簇組裝成hcp結構的動態進行更詳細的檢測。

通過對結果的分析可以得出，大部分從外圍結合到hcp結構區域的簇會以平均0.45秒的時間分解，而已經形成hcp結構的則相對更加穩定，可能原因是內部的lysenin寡聚體相互之間具有更多的結合位點，更難以分解。

小結：高速AFM成像可用于lysenin形成hcp結構的動態過程的研究。lysenin簇于膜上形成，經過大量的分解\重組和擴散形成hcp結構，隨著膜上hcp數量的增多而趨向于穩定。同時，我們還可以獲得簇的高度信息，用于表征lysenin與膜的結合以及穿膜通道的形成。

 2）膜蛋白的結構形成機制研究

膜聯蛋白（Annexin）是于真核細胞的細胞質內普遍存在的一種蛋白，與多種細胞膜功能相關，如胞吞、胞吐以及離子轉運等。膜聯蛋白在鈣離子環境下可結合至磷脂，進行細胞膜修復等作用，但至今對于膜聯蛋白-鈣離子-磷脂三者的組裝與分解的動態過程的研究仍處于空白。

這項研究中，研究人員使用日本RIBM的超高速視頻級原子力顯微鏡（HS-AFM）引導了膜聯蛋白V（A5）的組裝與分解并進行成像，分析了過程中的蛋白結構，動力學和分子間相互作用。

研究人員首先將雙層脂膜加入含2mM鈣離子的緩沖液，再加入A5并用HS-AFM成像。可以觀察到A5三聚體在膜上形成了六邊形晶格結構（標記1），并在中間含有縱向高度更低的三聚體（標記2）或者空洞（標記3），這與先前使用其他AFM和電鏡的結果相一致。