葉綠素知識與葉綠素熒光測定的原理（下）

1864年，德國科學家薩克斯做了這樣一個實驗：把綠色葉片放在暗處幾小時，目的是讓葉片中的營養物質消耗掉。然后把這個葉片一半曝光，另一半遮光。過一段時間后，用碘蒸氣處理葉片，發現遮光的那一半葉片沒有發生顏色變化，曝光的那一半葉片則呈深藍色。這一實驗成功地證明了綠色葉片在光合作用中產生了淀粉。

1880年，德國科學家恩吉爾曼用水綿進行了光合作用的實驗：把載有水綿和好氧細菌的臨時裝片放在沒有空氣并且是黑暗的環境里，然后用極細的光束照射水綿。通過顯微鏡觀察發現，好氧細菌只集中在葉綠體被光束照射到的部位附近；如果上述臨時裝片完全暴露在光下，好氧細菌則集中在葉綠體所有受光部位的周圍。恩吉爾曼的實驗證明：氧是由葉綠體釋放出來的，葉綠體是綠色植物進行光合作用的場所。　

將一片脫去淀粉的紫羅蘭葉片放在陽光下數小時之后用碘試劑檢測，可以發現只有葉片上綠色的區域變色而白色區域沒有，也就是說只有綠色區域有淀粉存在。這顯示了光合作用在缺乏葉綠素的情況下無法進行，葉綠素存在是光合作用的必要條件。

葉綠素 - 熒光現象和磷光現象

葉綠素的可見光波段的吸收光譜，在藍光和紅光處各有一顯著的吸收峰。吸收峰的位置和消光值的大小隨葉綠素種類不同而有所不同。葉綠素a最大的吸收光的波長420-663nm，葉綠素b 的最大吸收波長范圍在460-645nm。當葉綠素分子位于葉綠體膜上時，由于葉綠素與膜蛋白的相互作用，會使光吸收的特性稍有改變。（手持式葉綠素測定儀）

葉綠素的酒精溶液在透射光下為翠綠色，而在反射光下為棕紅色。這個紅光就是葉綠素受光激發后發射的熒光。這個現象就是熒光現象。其主要原理是由于葉綠素有兩個不同的吸收峰。葉綠素吸收光的能力極強，如果把葉綠素的丙酮提取液放在光源與分光鏡之間，可以看到光譜中有些波長的光被吸收了。因此，在光譜上就出現了黑線或暗帶，這種光譜叫吸收光譜。葉綠素吸收光譜的最強區域有兩個：一個是在波長為640nm-660nm的紅光部分，另一個在波長為430nm-450nm的藍紫光部分。對其他光吸收較少，其中對綠光吸收最少，由于葉綠素吸收綠光最少，所以葉綠素的溶液呈綠色。葉綠素的丙酮提取液在透射光下是翠綠色的，而在反射光下是綜紅色的。 葉綠素溶液的熒光可達吸收光的10%左右。而鮮葉的熒光程度較低，指占其吸收光的0.1%-1%左右。

熒光效應在植物生理學中有廣泛的應用。用這個效應可以研究植物的抗逆生理。因為在逆境下，植物的葉綠素會發生變換，研究其熒光，可以作為植物受逆境脅迫程度的指標。另外，還有一個磷光效應。就是當熒光出現后，立即中斷光源，用靈敏的光學儀器還可在短時間內看到微弱紅光，這就是磷光。（Chlorotech121A手持式葉綠素熒光測定儀）

葉綠素 - 生物合成與代謝

葉綠素a的生物合成途徑，是由琥珀酰輔酶A和甘氨酸縮合成δ-氨基乙酰丙酸，兩個δ-氨基乙酰丙酸縮合成吡咯衍生物膽色素原，然后再由4個膽色素原聚合成一個卟啉環──原卟啉Ⅳ，原卟啉Ⅳ是形成葉綠素和亞鐵血紅素的共同前體，與亞鐵結合就成亞鐵血紅素，與鎂結合就成鎂原卟啉。鎂原卟啉再接受一個甲基，經環化后成為具有第Ⅴ環的原脫植醇基葉綠素，后者經光還原、酯化等步驟而形成葉綠素a。

葉綠素在活體內也和其他物質一樣處于不斷更新狀態。它被葉綠素酶分解，或經光氧化而漂白。深秋時許多樹種葉片呈美麗的紅色，就是因為這時葉綠素降解速度大于合成速度，含量下降，原來被葉綠素所掩蓋的類胡蘿卜素、花色素的顏色顯示出來的緣故。

在植物衰老和儲藏過程中，酶能引起葉綠素的分解破壞。這種酶促變化可分為直接作用和間接作用兩類。直接以葉綠素為底物的只有葉綠素酶，催化葉綠素中植醇酯鍵水解而產生脫植醇葉綠素。脫鎂葉綠素也是它的底物，產物是水溶性的脫鎂脫植葉綠素，它是橄欖綠色的。葉綠素酶的最適溫度為60-82℃，100℃時完全失活。起間接作用的有蛋白酶、酯酶、脂氧合酶、過氧化物酶、果膠酯酶等。蛋白酶和酯酶通過分解葉綠素蛋白質復合體，使葉綠素失去保護而更易遭到破壞。脂氧合酶和過氧化物酶可催化相應的底物氧化，其間產生的物質會引起葉綠素的氧化分解。果膠酯酶的作用是將果膠水解為果膠酸，從而提高了質子濃度，使葉綠素脫鎂而被破壞。

在活體綠色植物中，葉綠素既可發揮光合作用，又不會發生光分解。但在加工儲藏過程中，葉綠素經常會受到光和氧氣作用，被光解為一系列小分子物質而褪色。光解產物是乳酸、檸檬酸、琥珀酸、馬來酸以及少量丙氨酸。因此，正確選擇包裝材料和方法以及適當使用抗氧化劑，以防止光氧化褪色。

葉綠素提取的準備工作是在一個半暗的房間里，室溫保持在25℃。提取步驟如下：

(1) 取1000克新鮮的綠葉，在韋氏攪切器中粉碎。

(2)將粉碎的1000克綠葉放進加有少量的碳酸鈣的丙酮中(溫度20℃)進行萃取，直到過濾、清洗后的葉子碎片為無色。

(3)將過濾后的丙酮提取液放到盛有1升石油醚和100ml丙酮的漏斗中，然后輕輕地旋轉，同時加放蒸餾水直到分層為止。水層的大部分丙酮和水溶雜質被丟棄，只剩石油醚溶液。

(4)將石油醚溶液用蒸餾水再次凈化后，用含有石油醚和0.01克草酸的200ml80%的甲醇溶液清洗5次以上，最后得到黃綠色懸浮液。

(5)用無水硫酸鈉對懸浮液進行干燥，并將其滲入到75px厚的蔗糖粉末制成柱中，然后用石油醚清洗沉淀的色素去掉類胡蘿卜素，使之只含有天然的葉綠素。

(6)含有天然葉綠素的蔗糖柱分兩層，綠層有4-10mm的葉綠素b層，另一藍層為2-6mm的葉綠素a層。

(7)將位于藍層正中的部分(約占藍層的一半) 放入醚中，對此懸浮液進行過濾、洗提，用蒸餾水清洗，用硫酸鈉干燥，再用器皿進行過濾后，得到葉綠素a。

(8)將(6)中的綠層中間部分移出，迅速放入醚中過濾、洗提，制成葉綠素b醚溶液。

葉綠素 - 用途

葉綠素產品

造血功能

諾貝爾得獎人Dr.Richard Willstatter和Dr.Hans Fisher發現：葉綠素的分子與人體的紅血球分子在結構上很是相似，唯一的分別就是各自的核心為鎂原子與鐵原子。因此，飲用葉綠素對產婦與因意外失血者會有很大的幫助。

幫助解除體內殺蟲劑與藥物殘渣

營養學家Bernard Jensen博士指出，葉綠素能除去殺蟲劑與藥物殘渣的毒素，并能與輻射性物質結合而將之排出體外。此外，他也發現一般上健康的人會比病患者擁有較高的血球計數，但通過吸收大量的葉綠素之后，病患者的血球計數就會增加，健康狀況也會有所改善。

養顏美膚

新英國醫藥期刊曾經做過這樣的報導：葉綠素有助于克制內部感染與皮膚問題。美國外科雜志報導：Temple大學在1200名病人身上，嘗試以葉綠素醫治各種病癥，效果極佳。

葉綠素 - 新聞動態

澳研究人員偶然提取到新型葉綠素，澳大利亞悉尼大學生命科學學院研究人員宣布，他們發現了一種新葉綠素，它在生物能源領域可望擁有廣闊的應用前景。

美國安諾實驗室的手持式葉綠素測定儀采用熒光光度法，免去傳統的化學法檢測水中葉綠素含量時需要對葉綠素進行萃取的步驟，直接檢測活體葉綠素，使檢測更加方便快捷。