常用分子生物學和細胞生物學實驗技術介紹（一）

核酸分子雜交技術

由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的靈敏性，它已成為分子生物學中最常用的基本技術，被廣泛應用于基因克隆的篩選，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測等。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫室度及離子強度等）可按堿基互補原成雙鏈。雜交的雙方是待測核酸序列及探針（probe）,待測核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細胞總RNA。核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質標記的，能與特定的核酸序列發生特異性互補的已知DNA或RNA片段。根據其來源和性質可分為cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。

固相雜交

固相雜交（solid-phase hybridization）是將變性的DNA固定于固體基質（硝酸纖維素膜或尼龍濾膜）上，再與探針進行雜交，故也稱為膜上印跡雜交。

斑步雜交（dot hybridization）

是道先將被測的DNA或RNA變性后固定在濾膜上然后加入過量的標記好的DNA或RNA探針進行雜交。該法的特點是操作簡單，事先不用限制性內切酶消化或凝膠電永分離核酸樣品，可在同一張膜上同時進行多個樣品的檢測；根據斑點雜并的結果，可以推算出雜交陽性的拷貝數。該法的缺點是不能鑒定所測基因的相對分子質量，而且特異性較差，有一定比例的假陽性。

印跡雜交（blotting hybridization）

outhern印跡雜交：凝膠電離經限制性內切酶消化的DNA片段，將凝膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉移至硝基纖維素膜或其他固相支持物上，經干烤固定，再與相對應結構的已標記的探針進行那時交反應，用放射性自顯影或酶反應顯色，檢測特定大小分子的含量。可進行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性長度多態性分析（RELP）等。

Northern印跡雜交:由Southerm印雜交法演變而來，其被測樣品是RNA。經甲醛或聚乙二醛變性及電泳分離后，轉移到固相支持物上，進行雜交反應，以鑒定基中特定mRNA分子的量與大小。該法是研究基因表達常用的方法，可推臬出癌基因的表達程度。

差異雜交（differential hybridization）

是將基因組文庫的重組噬菌體DNA轉移至硝酸纖維素膜上，用兩種混合的不同cDNA探針（如：轉移性和非轉移性癌組織的mRNA逆轉錄后的cDNA）分別與濾膜上的DNA雜交，分析兩張濾膜上對應位置雜交信息以分離差異表達的基因。適用于基因組不太復雜的真核生物（如酵母）表達基因的比較，假陽性率較低。但對基因組非常復雜的鹽酸核生物（如人），則因工作量太大，表達的序列所占百分比較低（僅5％左右），價值不大。

cDNA微點隈雜交（cDNA microarray hybridization）

是指將cDNA克隆或cDNA的PCR產物以高度的列陣形式排布并結合于固相支持物上（如：尼龍膜或活化的載玻片）以微點陣，然后用混合的不同DNA探針與微點陣上的DNA進行雜交。再利用熒光、化學發光、共聚焦顯微鏡等技術掃描微點陣上的雜交信息。它比差異雜交技術的效率高、速度快、成本低，適用于大規模的分析。已成商品問世。其缺點是無法克服保守的同源序列及重序對雜交信息的干擾。

寡核苷酸微點隈雜交（oligonucleotide microarray hybridization）

是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共價結合于支持物表面，與平均長度為20-50nt的混合RNA或cDNA探針進行雜交，以提高雜交的特異性和靈敏度。應用共聚焦顯微鏡可檢測跨越三個數量級的雜交信息。適用于低豐度mRNA的檢測，以區分基因家族不同成員的差異表達特征，或鑒定同一轉錄在不同組織和細胞中的選擇性剪接。但有工作量較大、成本較高、速度較慢等弱點。

液相雜交（solution hbridization）

指使變性的待測核酸單鏈與放射笥核素標記的已知的酸單鏈（探針）在溶液中保溫，使之形成雜交復合物。反應結束后，用羥磷灰石法或酶解法將未被雜交的單鏈和雜交雙鏈分開，然后結膈后在雜妝分子中的探針量，就可推算出被測的核酸量。

遞減雜交（subtractive hybridizatio）

是利用兩種來源一致而功能不同的組織細胞提取mRNA（或逆轉錄成的cDNA）,在一定的條件下以過量的驅動mRNA或cDNA與測試的單鏈cDNA或mRNA進行液相雜交，通過羥基磷灰石柱層析篩選除去兩者間同源的雜交體。經多輪雜交策選、除去兩者之間相同的基因成分，保留特異表達的目的基因或工基因片段。以后者篩選cDNA文庫，可獲得特異表達的目的基因cDNA全長序列。