實時熒光定量PCR技術介紹

發布時間：2020-04-21 21:34 原文鏈接：實時熒光定量PCR技術介紹

實時熒光定量PCR (real time fluorogenetic quantitative PCR, FQ-PCR)，是在PCR定性技術基礎上發展起來的核酸定量技術。它是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR過程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術不僅實現了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現多重反應、自動化程度高、無污染性、具實時性和準確性等特點，目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫學研究等領域。

在熒光定量PCR技術中，有一個很重要的概念是Ct值。C代表Cycle, t代表threshold, Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。

研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可做出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。

熒光定量PCR所使用的熒光物質可分為2種：熒光染料和熒光探針。熒光染料法是指SYBR Green I法，熒光探針法包括Taqman探針法、LightCycler法和分子信標（Molecularbeacon）法。

SYBR Green I法是在PCR反應體系中加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。擴增產物序列特異性通過反應后變性分析來確證。在反應的最后階段，反應體系的溫度逐漸升高，雙鏈DNA慢慢地變成單鏈，從而SYBR Green I染料釋放出來，導致熒光強度的慢慢降低，測定整個過程的熒光強度，可以獲得PCR產物的變性溫度，因為每一種PCR產物都有不同的長度和GC百分比，所以也具有特征性的變性溫度。通過變性曲線得到的產物大小可以和PCR產物的電泳結果相比較。這種方法在檢測禽肉中的沙門氏菌和干凍食品中的細菌活性方面已有報道。

Taqman探針法是利用Taq DNA聚合酶的5'→3'核酸酶活性來酶切和降解標記報告熒光基團和淬滅熒光基團的探針，所以稱為Taqman探針。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，PCR擴增時，Taq酶的5'→3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。PCR擴增產物的指數增加和熒光強度的增加是相對應的。這個系統現在已經商品化，TagMan系統已經被用來檢測食物或者純培養物中的單核增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌0157: H7和沙門氏菌。

分子信標探針是一種具有莖和環狀結構的單鏈核酸分子，探針分子中環狀部分的序列和靶核酸的主要已知序列互補，莖部是通過探針序列任何一側的2個互補臂序列退火形成。臂序列和靶序列沒有關系，一個熒光基團貼附在一個臂的終端，一個非熒光基團貼附在另一個臂的終端。莖部使得這2個基團緊緊地貼在一起。從而使得熒光團釋放出來的熒光被FRET淬滅。熒光團一淬滅對的原理是熒光團接收到的熒光轉移到淬滅物上，消散為熱而不是光，結果熒光團不能釋放熒光。但是當探針遇到靶分子時，形成的雜交物比通過臂序列形成的雜交物長并且穩定，因為核酸的二級螺旋結構相對堅硬，探針和靶序列的雜交就排除了同時存在臂序列雜交的可能。這樣，探針就經過自然結構的改變而使臂序列分開，進而使熒光團和淬滅物相互分離。因為熒光團和淬滅物不再緊密地連接在一起，所以在紫外線燈照射下能夠產生熒光。這種方法對致病性反轉錄病毒的檢測、沙門氏菌和大腸埃希氏菌0157的檢測都有應用。

核酸雜交法

核酸雜交技術是分子生物學領域中最常用的基本技術方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下（適宜的溫度及離子強度等）可以按堿基互補原則退火形成雙鏈。此雜交過程是高度特異性的。雜交的雙方分別是待測核酸序列及探針。用于檢測的已知核酸片段稱之為探針（probe)。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標記，以便于隨后的檢測。常用的標記物是放射性核素、地高辛半抗原（digaoxigenin)，生物素(biotin)，辣根過氧化物酶(HRP)，還可以標記一些熒光物質如異硫氰酸熒光素（FITC),花青（cyanine, Cy2, Cy3, Cy5）等。

核酸雜交中經常使用的是印跡雜交技術。印跡雜交技術是指將帶檢測的核酸分子結合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標記的核酸探針進行雜交的過程。其操作基本流程是：首先用凝膠電泳將待測核酸片段分離，然后用印跡技術將分離的核酸片段轉移到特異的固相支持物上，轉移后的核酸片段將保持其原來的相對位置不變。再用標記的核酸探針與固相支持物上的核酸片段進行雜交。最后洗去未雜交的游離探針分子，通過放射自顯影等檢測方法顯示標記的探針的位置。由于探針已與待測核酸片段中的同源序列形成雜交分子，探針分子顯示的位置及其量的多少，則反映出待測核酸分子中是否存在相應的基因序列及其量與大小。

用于核酸雜交的固相支持物的種類很多。常用的主要有硝酸纖維素膜（nitrocellulose) ,尼龍膜（nylon membrane)、化學活化膜（chemical activated paper）等。印跡的方法也有多種：可以直接將核酸樣品點樣于固相支持物上，稱為斑點或狹縫印跡法；利用毛細管虹吸作用有轉移緩沖液帶動核酸分子轉移到固相支持物上；利用電場作用的電轉法；利用真空抽濾作用的真空轉移法。

在微生物診斷和鑒別方面一個重要的發展就是核酸探針的引進。它可以解決使用抗體檢測微生物時存在的非特異性問題。核酸雜交方法的一個主要不利方面，是需要相對大量的樣本量（典型的104-105細菌）才能獲得明確的結果，因為樣品中同時含有大量的非特定微生物會干擾雜交結果，所以，在食品微生物方面主要是利用瓊脂平板上的細菌進行菌落原位印跡雜交。