動物細胞培養及外源基因導入的原理和操作步驟（二）

實驗試劑

1. 細胞營養液（DMEM液體培養基，10％胎牛血清，雙抗100單位/ml），消化液（0.05％胰酶，0.53mM EDTA·Na），Hank’s液。

2. 2×HBS液（280mMNaCl, 10mMKCl, 1.5mMNaHPO₄·2H₂O, 12mM葡萄糖，50mMHepes，pH7.05, 0.2μ過濾除菌），CaCl₂（2.5M，0.2μ過濾除菌）溶液，超純水（滅菌）。

3. PBS，蛋白酶K，NP40，RNaseA，無水乙醇，酚/氯仿，DNA上樣緩沖液，瓊脂糖，TAE電泳緩沖液，EB。

實驗設備

1. 10cm細胞培養皿

2. 50ml、15ml一次性離心管

3. 10ml玻璃吸管（滅菌），與玻璃吸管配套的吸球及膠管

4. 二氧化碳培養箱

5. 倒置顯微鏡

6. 20μl，200μl微量移液器

7. 1.5ml離心管（滅菌）

8. 200μl微量移液器頭

9. 1ml微量移液器

10. 低速臺式離心機

11. 高速臺式離心機

12. 4°C，－20°C冰箱

13. DNA凝膠電泳設備

14. 紫外凝膠成像儀

實驗材料

胚腎細胞系293，TNF－R1哺乳動物細胞表達質粒（CsCl超速離心純），哺乳動物細胞表達載體（CsCl超速離心純）。

實驗步驟

1. 293細胞的傳代培養（第一天） 
   

1) 顯微鏡觀察母細胞的生長狀態，確定傳代比例。

為了獲得較高的轉染效率，必需保證細胞處于合適的生長密度，因此應根據母細胞的生長密度調整傳代比例。磷酸鈣轉染的合適細胞密度為50％－70%，本實驗中使用的293細胞長成致密單層后一般按照1：6傳代即可。

2) 在酒精燈旁打開培養皿蓋，倒去皿中的細胞營養液，加入2mlHank’s液，輕輕搖動，將溶液倒出。 

3) 消化與分裝。 

在培養皿中加入1ml消化液（0.53mMEDTA, 0.05%胰蛋白酶液），37°C靜置5分鐘左右，顯微鏡觀察，如果細胞變圓且彼此分離表明消化完全，此時可加入10ml營養液終止消化，吹打數次，使培養皿壁上的細胞全部脫落下來，并分散形成均勻的細胞懸液。按照傳代的比例補加適當體積的營養液，吹打混勻后分裝到新的培養皿中。

在分裝好的細胞培養皿上做好標記，置于37°C二氧化碳培養箱中培養。 

2. 用磷酸鈣介導的外源質粒轉染法在293細胞中過量表達TNF－R1（第二天） 

1) 顯微鏡觀察待轉染細胞的生長狀態 

a. 觀察細胞是否污染 

b. 觀察培養液顏色的變化 

c. 觀察細胞的生長密度 

2) 轉染 

a. 用微量移液器在1.5ml離心管中依次加入10μg（1μg /μl, 10μl）質粒DNA（實驗組為TNF-R1的哺乳動物細胞表達載體，對照組為空載體），350μl超純水，40μlCaCl2(2.5M)溶液，混勻。 

b. 在另一1.5ml離心管中加入400μl2×HBS，將A液分三次緩慢加入，每次加入A液后用吹氣泡的方法混勻。室溫靜置5分鐘。 

c. 將A，B混合液均勻地滴加在待轉染的293細胞培養液中，輕輕晃動使混勻。將培養皿置于37°C二氧化碳培養箱中。 

3. 凋亡細胞的形態觀察，“DNA Ladder”的提取及瓊脂糖電泳分析（第三天） 

1) 顯微鏡觀察過量表達TNF-R1（實驗組）和空載體（對照組）的293細胞形態上的差異。 

2) 用10ml玻璃吸管將實驗組和對照組培養皿中的細胞輕輕吹打下來，收集到15ml離心管中，2000rpm離心5分鐘，沉淀用1mlPBS重懸，轉移到1.5ml離心管中，2000rpm離心3分鐘，去除上清液，加入200μlPBS(0.2mg/ml 蛋白酶 K)，重懸細胞，再加入200μlPBS（2％NP40），顛倒混勻，4°C作用30分鐘，期間顛倒數次。12,000rpm離心2分鐘，吸出上清，加入1ml乙醇，顛倒混勻，－20°C靜置10分鐘，12,000rpm離心10分鐘，沉淀溶于50μl水中，加入RNaseA(10mg/ml)，37°C靜置20分鐘。 

3) 在DNA溶液中加入10μlDNA上樣緩沖液，取出50μl進行2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像儀拍照。