RNA酶處理、基于DNA含量做標準曲線的CyQUANT實驗法
細胞增殖同樣可以用DNA含量來評價并作出標準曲線。根據細胞曲線可計算出DNA含量，細胞裂解液經過RNA酶處理就排除了RNA對結果的干擾。在本應用說明中，列出了用DNA含量做標準曲線來定量細胞樣品的設置步驟。
準備試劑
步驟1：制備1X細胞裂解液，用蒸餾水以1:20稀釋細胞裂解液儲存液，需制備每孔200μL。一部分細胞裂解液加入1mMEDTA和180mMNaCl，一部分不加EDTA和NaCl。
步驟2：制備1X和2XCyQUANTGR染液/細胞裂解液，用1X細胞裂解液以1:400或1:200稀釋CyQUANTGR染液儲存液。稀釋液需置于塑料器皿中，而非玻璃器皿中。
在塑料管中制備DNA標準樣品
步驟1：用1X細胞裂解液稀釋試劑盒中100μg/mLDNA標準樣品，稀釋成1μg/mL存儲液。
步驟2：將DNA存儲液按表4所列按梯度稀釋。
注意：CyQUANT試劑盒中的是λ噬菌體DNA，本文中的數據都是按標準梯度稀釋。對于自己的實驗也可選擇其他來源的DNA樣品，具體操作請參考產品說明書MP-7026。
準備細胞
依據所用的細胞系(貼壁還是不貼壁)，按照Life Technologies的CyQUANT說明書選擇適當的細胞培養(微孔板中還是培養皿中)和凍存方法，在-70℃凍存細胞。本文中，貼壁細胞要先從培養皿中消化下來，然后離心，并將離心得到的細胞斑塊凍存。
準備細胞樣品、標準曲線DNA樣品和空白
步驟1：將之前冷凍的離出細胞放在室溫幾分鐘解凍。加入1mLCyQUANTGR染液/細胞裂解液，渦旋使細胞重懸。
步驟2：預處理細胞，每孔中加入含1mMEDTA和180mMNaCl的細胞裂解液，并在4個沒有細胞的孔中加入同樣的細胞裂解液(空白對照孔)。如果樣品為之前冷凍的細胞離心斑塊，先用100μL裂解液重懸，然后轉移到微孔板中。在有細胞的樣品孔和空白對照孔中分別加入4μLRNA酶(每孔兩個單位，詳見下文)。室溫孵育1小時。
注意：無DNA酶的RNA酶處理細胞時濃度不超過10μL中含有飽和活性單位。例如，試劑盒中混合RNA酶濃度為500U/mL，所以每4μL中含有兩個活性單位。
步驟3：在有細胞的樣品孔和空白對照孔中分別加入100μL2XCyQUANTGR染液/細胞裂解液。
步驟4：將之前準備的DNA梯度稀釋液依次加入到微孔板中，孔板中因包含兩種對照，一種是加入稀釋液但無DNA的空白對照，另一種是只含有1XCyQUANTGR染液/細胞裂解液的孔板空白對照(無DNA和RNA酶)。
步驟5：室溫孵育2-5分鐘
設置儀器和軟件參數
步驟1：打開微孔板讀板儀開關，打開SoftMaxPro軟件并點擊ProtocolLibrary中CellGrowth&Viability文件夾中的CyQUANTFluorescenceprotocol。
步驟2：按表2中所示參數設置儀器，此設置已在預配置的列表中。
步驟3：使用TemplateEditor設置孔板加樣的模板，包括標準樣品孔、孔板空白對照孔和樣品孔(RNA酶處理的細胞)的位置。
讀板和數據分析
步驟1：將微孔板放于讀板機中。
步驟2：點擊軟件的Read鍵。
步驟3：儀器將對微孔板進行讀值后，相關的熒光值(RFUs)將出現在軟件的孔板位置，數據將依據設置分析出結果，并顯示在Grouptables中。
步驟4：TemplateEditor里設置了標準曲線組的話，DNA標準曲線將會有軟件自動生成。
步驟5：在CurveFit下拉菜單里可以選擇擬合曲線公式，本應用說明的標準曲線選擇的是log-log曲線擬合。
步驟6：軟件通過標準曲線公式計算出每個DNA樣品的濃度，并顯示在Unknownsgroup部分。
DNA標準曲線結果
基于細胞的標準曲線如前文所述，呈現在圖3中。在生成標準曲線時采用了log-log擬合算法，圖中所示結果是SpectraMaxM5微孔板讀板機得到的，MolecularDevices公司的其他具有熒光功能的讀板機均可得到相似結果(數據未顯示)。用RNA酶處理細胞檢測DNA含量做標準曲線的例子現實在表5中。在此應用說明中，一個系列的細胞濃度被計算。事實上，每孔細胞個數在50-50,000個之間(標準曲線范圍內)均可用此方法計算得到細胞DNA濃度。
圖4顯示橫坐標為每孔細胞個數，縱坐標為平均DNA含量，曲線范圍為50-50,000個細胞，結果如試劑盒說明書所述。圖5中顯示了RNA酶處理的和未處理的細胞樣品RFUs值的比較，說明RNA酶處理會降低細胞裂解液的熒光強度。
總結
CyQUANT細胞增殖實驗是快速的、靈敏的檢測細胞個數和細胞DNA含量的熒光方法。SpectraMax M5微孔板讀板機得到的數據結果與Molecular Devices公司的其他具有熒光功能的讀板機得到的結果相似。基于細胞的標準曲線和5分鐘的孵育，我們得到了與CyQUANT試劑盒相似的動態范圍(50-50,000個細胞)。應用λ DNA樣品得到的曲線及通過標準曲線計算DNA含量的下限位50個細胞。結合應用SoftMaxPro的軟件分析功能及預置的CyQUANT拍攝設置，提供了一個計算和得到數據便捷的方法。
參考文獻
1. Life Technologies Product InformationsheetMP 7026 1/12/01: CyQUANT CellProliferation Assay Kit (C-7026).