環狀RNA—隱秘的未知RNA平行宇宙
環狀RNA，被喻是隱秘的未知RNA平行宇宙。最近，復旦大學的鄭秋鵬博士（2016交流會嘉賓之一）以第一作者身份在Nature Communications上發布了他們關于circHIPK3的最新研究成果。現在就和小編一起來學習circRNA的研究思路，認識圓圈重塑的RNA世界吧。
環狀RNA測序的樣本選擇、分析方法
RNA測序分析來自6個正常組織（腦、結腸、心臟、肝、肺、胃）和7個癌癥組織（膀胱尿路上皮癌、乳癌、結直腸癌、肝癌、胃癌、腎透明細胞癌、前列腺癌）的去核糖體RNA后的總RNA，發現了67,358個潛在的環狀RNA，其中27,296含有至少兩個unique back-spliced reads。
研究者使用RefSeq database 24對這些環狀RNA進行注釋；環狀RNA表達差異使用Wilcoxon rank-sum test計算，比較癌癥樣本與相應正常組織樣本。
初步鑒定預測的新環狀RNA
為排除它們是線性的反式剪接產物，研究者檢測了它們的物理特性。針對36個共同表達的待鑒定環狀RNA轉錄本，設計了Outward-facing引物。每對引物分別擴增一個來自HEK-293T cDNA的不同產物。在RNase R處理后，全部36個back-spliced序列都明顯存在。
選擇哪個環狀RNA繼續下游功能研究呢？
通過錨點比對 (Anchor alignment)，根據它們的線性形式，給測序數據中每一個環狀RNA進行豐度定量。研究者檢測了它們的5’端和3’端成環比 (circular ratio，CR)，以5’ CR>0.2; 3’ CR>0.2; SRPBM>1為標準時，得到了990個高豐度表達的環狀RNA。研究者留意到，這里面的其中一個環狀RNA來自于HIPK3基因Exon2，命名為circHIPK3，豐度與back-spliced（反向剪接）比都很高。
多維尺度法篩選高豐度circRNA。紅點和黑點分別表示高豐度和低豐度circRNA，circHIPK3以藍點顯示。灰色部分為篩選得的高豐度circRNA。
環狀RNA研究第一步：鑒定環狀
研究者使用outward-facing引物擴增出了預期大小的不同產物，并通過sanger測序確定了序列。環狀的表達水平通過qRT-PCR檢測，結果與RNA-seq一致，在多種組織里的表達量均高于其線性形式。
然后研究者檢測了它在HeLa細胞中的穩定性和定位情況，用Actinomycin D（轉錄抑制劑）處理細胞后，環狀RNA仍具有高穩定性，并能抵抗RNase R外切酶消化，表明它確實為環狀形式。
e) qRT-PCR顯示了circHIPK3和HIPK3 mRNA在HeLa細胞質或核。f) circHIPK3的RNA FISH實驗。
circHIPK3是如何形成的？
HIPK3 Exon2兩側的外顯子分析顯示，高度互補Alu重復序列與28個短散在重復序列 (SINE) 處在HIPK3 Exon2上游的內含子中，51個SINE處于Exon3下游。研究者使用CRISPR/Cas9技術，去除了HEK-293T細胞中的circHIPK3側翼Alu序列，結果發現下游Alu序列刪除后，環化被抑制，但上游Alu刪除后不僅沒有減少circHIPK3的生成，還稍微增加了。
示意圖顯示基因組上HIPK Exon2區域含有側翼Alu重復序列和長內含子。Alu元件和長內含子使用CRISPR/Cas9系統進行刪除(gRNA1-6)。在gRNA兩側的引物用于檢測刪除效果(P1-5)
引物環狀外顯子的上游有許多Alu元件，研究者猜測內含子中有其他Alu元件可能促進環化，于是刪除了上游大的內含子 (gRNA5、gRNA6)，結果circHIPK3顯著下調，而HIPK3 mRNA沒有變化，證明刪除只影響back spilcing，而不影響典型的剪接，表明帶Alu互補重復序列的側翼長內含子，是circHIPK3生成所必需的。
使用4對gRNA把序列刪除(gRNA3-6)，進行普通PCR和qRT-PCR，引物位點設計在刪除區域外(P4+P5)