優化色譜質譜參數獲得理想的單抗輕重鏈分子質量（一）

1. 前言

現在，越來越多的生物制藥公司開始使用 Orbitrap 類型的質譜進行單抗藥物的表征分析，包括完整分子質量、輕重鏈分子質量、肽圖、糖鏈、二硫鍵、宿主蛋白殘留等等。基于分子質量測定的方法更加快速和直接，尤其是通過單抗輕重鏈分子質量測定的方法，不僅可以得到分子質量的信息，而且可以獲得和輕重鏈相關的二硫鍵信息、部分氨基酸后修飾位點的信息，糖基化結合位置的信息、ADC 結合位置的信息等等，同時，相對于完整分子質量的分析，單抗輕重鏈分子質量測定可以幫助客戶獲得更加細化和準確的信息。在實際樣品分析的過程中，我們可以通過優化色譜分離條件、質譜分析條件來獲得最佳的輕重鏈分子質量譜圖和相關信息。

目前，基于 Orbitrap 類型的 Q-Exactive 系列、LTQ-Orbitrap 系列、Orbitrap-Fusion 系列的質譜儀器都可以進行各種類型的單抗表征分析，在這里我們以 Q-Exactive plus 儀器為測試平臺，進行了單抗輕重鏈分子質量分析的色譜和質譜參數優化，相似的參數可以直接應用到其它基于 Orbitrap 類型的質譜儀器上，為生物制藥客戶的實際樣品分析提供了參考依據。

2. 實驗部分

2.1 儀器和試劑

質譜儀器：Q-Exactive plus（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜儀器：Dionex 3000 液相色譜系統（賽默飛世爾科技，美國）；

色譜柱：Agilent Zorbax 300，SB-C8, 3 μm，2.1×50 mm；

試劑：二次去離子水，色譜級乙腈，色譜級甲酸，DTT（Sigma-Aldrich）。

2.2 樣品前處理方法

1 mg/mL 的 Herceptin 及其脫糖形式的單抗溶液，在保證 DTT 終濃度 20 mM 的條件下，37℃ 反應 2 小時，然后直接用于后續色譜質譜分析。

2.3 色譜質譜分析方法

色譜分析條件：具體見表 1；

表 1. 輕重鏈分子質量測定的色譜分析條件

（備注：該應用報告中，使用了 2 種不同的色譜梯度，10 分鐘和 15 分鐘，括號中為 15 分鐘色譜梯度的設置參數。）

質譜分析條件：具體見表 2；

表 2. 輕重鏈分子質量測定的質譜分析條件

2.4 數據分析方法

采用 Protein Deconvolution 4.0 軟件對原始質譜圖進行去卷積處理，幾個重要的參數需要進行調節，1）Target Mass：輕鏈為 23000 Da，重鏈為 46000 Da；2）Minimum Adjacent Charge：6 to 10；3）Mass Tolerance：20 ppm；4）Noise Rejection：99% confidence；5）m/z range：根據原始質譜圖中的信號分布進行調整；6）Output Mass Range：根據 target mass 進行調整，最后得到單抗輕重鏈去卷積后的分子質量信息。

3. 結果與討論

3.1 源內碎裂（SID）質譜參數對單抗輕重鏈分子質量測定的影響

影響蛋白分子量測定的因素有很多，包括：流動相、溶液體系（不揮發性鹽）、雜質成分、樣品濃度、pH 值、樣品在源內分解或碎裂、質譜分辨率等情況。在單抗輕重鏈測定的過程中，我們也會考慮到這些因素，一般我們選用 0.1% 甲酸的水溶液和 0.1% 甲酸的乙腈溶液作為流動相；如果單抗原溶液中含有不揮發性鹽，我們建議進行脫鹽處理，比如說使用超濾管脫鹽，同時如果含有 SDS、Tween 等表面活性劑或者去垢劑最好也進行超濾或者使用其它表面活性劑和去垢劑去除試劑盒進行去除；如果含有雜質成分，也需要根據雜質的組成和性質進行雜質去除；樣品的濃度不能太低，否則信噪比低，造成質量誤差增大。以上這些參數主要同樣品前處理相關，需要作樣人員在質譜分析前進行前處理制備。而對于在質譜分析中，可以調節的參數主要是源內碎裂能量（SID），在這里我們就一起探討一下該參數對輕重鏈分子質量的影響。

詳細質譜參數如表 2 所示，源內碎裂能量（SID）使用 0/30/50/70 和 100 eV 五個不同的電壓參數進行數據的采集，輕鏈的原始質譜圖如圖 1 所示，重鏈的原始質譜圖如圖 2 所示，從圖 1 和圖 2 中，我們可以看到，隨著 SID 能量的增加，輕重鏈的質荷比分布向高質量端移動，并且在 70 eV 的時候發生了顯著的質荷比移動和信噪比的降低，這主要是由于施加的電壓增大，輕重鏈發生降解的可能性增多，以致質譜峰信噪比降低，峰強度降低，而輕鏈相對分子量比較小，比較簡單，因此信號改變不是很明顯，但對于重鏈，我們可以很明顯的觀察到這個現象。因此在實際樣品的測試中，考慮到信噪比和強度這兩個重要的因素，我們可以在 0–50 eV 的電壓值下進行優化（當然也不排除樣品特殊的情況下，我們也可以提高 SID 值進行優化），在 Herceptin 樣品的測試中，我們選擇 30 eV 進行后續的樣品采集和進一步的色譜條件優化。