三種流式方法檢測細胞凋亡

一、檢測原理

細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但其程度介于正常細胞和壞死細胞之間。利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。

流式細胞儀檢測有下列特點

1、檢測的細胞數量大，因此其反映群體細胞的凋亡狀態比較準確

2、可用許多相關分析

3、結合被測細胞DNA含量分析，可確定凋亡的細胞所處的細胞周期。但該法周樣也具有標本制作復雜。非原位檢測，不易與變性細胞鑒別等因素的限制。

二、檢測方法

1、檢測形態學及細胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法

細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但其程度介于正常細胞和壞死細胞之間，利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，采用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。

常用Hoechs-PI染色法，正常細胞對染料有拒染性，熒光著色很淺，凋亡細胞主要攝取hoechs-PI染料，呈現強藍色熒光，而壞死細胞主要攝取碘化丙啶（PI）而呈紅色熒光。

2、DNA片段原位標記

凋亡細胞DNA片段原位末端檢測技術是指在細胞（或組織）結構保持不變的情況下，用熒光素、地高.辛或生物素標記的脫氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，UDTP）和末端脫氧核苷酸轉移酶（terminal deoxynucleotidy1 transferase，TdT）相反應與凋亡細胞裂解后3'的羥基（-OH）端相結合經顯色反應后檢測DNA裂解點的技術。

DNA片段原位標記法有兩種

（1）原位缺口轉移（in situ nick-translation，ISNT）技術，該技術是1994年由Fehsel等提出，它是利用DNA多聚酶I將標記的核苷酸接到斷裂的3'-OH端

（2）原位缺口末端原位標記技術（in situ end labelling technique，ISEL）， 該技術即TUNEL法，于1993年由Wijsman等提出， 它是利用TdT將標記DUTP接到3'-OH端。研究證明，TUNEL的敏感性遠高于尤其對早期凋亡的檢出TUNEL更為適用。其原因可能是凋亡發生時DNA大多是雙鏈同時斷裂而單鏈斷裂少見。ISNT是依賴DNA多聚酶I的單鏈修復反應，故陽性率較低。細胞凋亡時DNA斷裂早于形態學改變及DNA含量減少。因此該法較前述各法具有更高的靈敏性，但環死細胞亦有DNA裂點形成。因此環死亦可呈TUNEL陽性反應。

3、檢測細胞膜成分變化的Annexin V聯合PI法

（1）檢測原理

在細胞凋亡早期位于細胞膜內側的磷脂酰絲氨酸（PS）遷移至細胞膜外側。磷脂酰結合蛋白V（Annexin V）是一種鈣依賴性的磷脂結合蛋白，它與PS具有高度的親合力。因此，Annexin V可以作為控針檢測暴露在細胞膜表面的PS。故利用對PS有高度親和力的Annexin V， 將Annexin V標記上熒光素，同時結合PI拒染法進行凋亡細胞雙染后用流式細胞儀即可檢測凋亡細胞。

（2）結果判斷

正常活細胞Annexin V、PI 均低染；凋亡細胞Annexin V 高染、PI低染；壞死細胞Annexin V、PI 均高染。

（3）應用價值

細胞發生凋亡時，膜上PS外露早于DNA斷裂發生，因此Annexin V 聯合檢測早期細胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。 又Annexin V 聯全PI染色法不需固定細胞，可避免PI染色法因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL法固定造成的DNA片段丟失。因此，Annexin V聯合法PI更省時，結果亦更為可靠，是目前最為理想的檢測細胞凋亡的方法。