多肽的合成與應用進展（一）

  多肽是分子結構介于氨基酸和蛋白質之間的一類化合物,由一種或多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結合而成。多肽是構成蛋白質的結構片段,也是蛋白質發揮作用的活性基團,是人體進行代謝、調控活動的重要物質。蛋白質主要以多肽形式吸收,透過多肽既可深入研究蛋白質的性質,又為改變和合成新的蛋白質提供了基礎材料。研究多肽結構與功能的關系,有助于了解多肽中各氨基酸系列的功效,以便應用中設計盡可能短的多肽同時提高其生理活性,減少臨床的不良反應。隨著美國FDA1999年開始允許大豆蛋白制品標注可以預防心血管疾病的功能和人們對多肽中各氨基酸系列的功效的不斷了解,作為藥物和營養品的多肽產品不斷被開發出來,多肽的研發已成為近年生命科學研究的一大熱點[1~7]。

　　1 多肽的合成

　　1.1 多肽合成的分類

　　多肽合成主要有兩條途徑:化學合成和生物合成。化學合成主要通過氨基酸縮合反應來實現。為得到具有特定順序的合成多肽,當合成原料中含有官能度大于2的氨基酸單體時,應將不需要反應的基團暫時保護起來,然后再進行連接反應,以保證合成的定向進行。

　　多肽的化學合成有固相合成和液相合成之分,其主要的區別在于是否使用固相載體。多肽液相合成主要有逐步合成和片段組合兩種策略,逐步合成簡潔迅速,被用于各種生物活性多肽片段的合成;片段組合法為合成含100個以上氨基酸的多肽提供了最有前途的路線,并已成功地合成了多種有生物活性的多肽,其最大的特點是易于純制。1963年,Merrifield創立了固相合成法,將氨基酸的C末端固定在不溶樹脂上,然后在此樹脂上依次縮合氨基酸、延長肽鏈。固相合成法又可分為Boc(叔丁氧羰基)法和Fmoc(9-芴甲基氧羰基)法。在傳統液相和固相合成多肽方法的基礎上,人們又發展了氨基酸的羧內酸酐(NCA)法、液相分段合成法、組合化學法等。

　　在生物合成多肽方面,除了常用的發酵法、酶解法外,隨著生物工程技術的發展,DNA重組技術也被應用于多肽合成。

　　1.2 氨基酸的羧內酸酐法[8,9]

　　氨基酸的羧內酸酐是氨基酸的一種衍生物,它的氨基保護基也活化羧基。NCA法屬于陰離子開環聚合機理,其引發劑可選用多種親核試劑或堿類。采用NCA法合成多肽的基本反應包括:在堿性條件下,氨基酸陰離子進攻NCA形成較為穩定的氨基甲酸根離子,在酸化時該離子失去二氧化碳生成二肽。生成的二肽又進攻其它的NCA,如此反復進行下去(圖1)。

　　NCA法具有合成周期短、操作簡單、成本較低、產物分子量高等優點,在目前多肽合成中所占比例較大,技術也較為通用。但是,采用NCA逐步法只能合成短鏈多肽片段[9]。

　　1.3 液相分段合成法[10~19]

　　液相分段合成法是多肽片段在溶液中依據其化學專一性或化學選擇性,自發連接成長肽的合成方法,其優點是能得到長肽,但技術還不完善。常用的連接技術主要有:天然化學連接[11]、化學區域選擇連接[12,13]、可去除輔助基連接[14]、光敏感輔助基連接[15]、施陶丁格連接[16,17]和正交化學連接[18,19]。

　　天然化學連接方法(圖2)是以C端為硫酯的多肽與N端為半胱氨酸(Cys)殘基的多肽反應得到以Cys為連接位點的多肽。由于連接所合成的多肽必須含Cys殘基,限制了該方法的應用。

　　化學區域選擇連接方法(圖3)是以2-巰芐基作為輔助基與硫酯反應。加快了縮合速度,輔助基易脫除,且去除輔助基連接是以苯胺的衍生物NA-(1-苯基-2-巰乙基)為輔助基團,對強酸保持穩定,使得N端多肽片段較易合成。

　　光敏感輔助基連接方法(圖4)是以NA-2-巰基-1-(2-硝基苯)乙基為輔助基(見光分解易脫除)多肽合成的。