PPO粗酶液的純化

一、原理

1.葡聚糖凝膠SephadexG-200凝膠柱層析利用大分子不能進入凝膠顆粒內部最先流出柱外，而小分子物質進入凝膠顆粒內部，流速慢而最后流出柱外，凝膠層析法能將不同分子大小的物質分離開。（G-200能分離800-80000D分子量的蛋白質）

2.利用離子交換法，選取DEAE-陰離子纖維素DE52柱材料，因為PPO是帶有陽離子的蛋白質，在層析時會吸附在柱材料上，而雜蛋白會洗下。后用NaCl梯度洗脫PPO，（NaCl為強離子交換劑，能將弱吸附在柱材料上的PPO置換下來）。粗酶液從而得到純化。

二、材料與試劑

試劑：0.02MTris-HCL緩沖液Ph7.4(內含0.001MEDTA)配制時配×10倍濃縮液1000ml;NaCL;聚已二醇；DEAE-纖維素DE52；葡聚糖凝膠SephadexG-200;蘭葡萄糖－40、70、100等；

實驗器械與儀器設備：試管與試管架、燒杯、玻璃攪棒、移液管、滴管等；試劑瓶、層析柱、pH計和pH試紙、恒流泵、梯度混合儀、核酸蛋白監測儀、GL-20C高速冷凍離心機、DL-7A大容量低速冷凍離心機

三、操作步驟

1．葡聚糖凝膠的處理、裝柱及平衡

（1）柱材處理

稱取一定量的SephadexG-200干粉，加無離子水或蒸餾水浸泡溶脹48h,去掉懸浮的細微顆粒，為防止凝膠顆粒中的空氣存在，影響層析效果，凝膠裝柱前一定要將凝膠液中的氣體除掉，其辦法是將凝膠液放進抽濾瓶中，進行抽真空處理，直到凝膠液中沒有氣泡出現為止。

（2）裝柱

將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的凝膠液（凝膠的濃度過高會產生氣泡，影響蛋白質分離速度，濃度過低易產生凝膠分層，影響蛋白質的分離效果）輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降在層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5-2cm處，停止裝柱，剪一與柱內徑相等的濾紙片覆蓋于凝膠上。層析柱上端進液口連接恒流泵，下出液口連接蛋白質監測儀，待層析柱的平衡。

（3）平衡

在柱層析上樣前必須對層析柱進行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過程的緩沖液（洗脫液）置換出來，使層析柱中的緩沖系統與柱層析過程中的系統一致。其方法是：利用層析柱上端的恒流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時，層析柱達到了平衡。在本實驗中，用0.002MTris-HCL緩沖液PH7.4(內含0.0001MEDTA)，平衡SephadexG-200凝膠。

2．上樣：將粗酶液上柱。

3．洗脫：用0.02MTris-HCL緩沖液Ph7.4（內含0.001MEDTA）洗脫，收集洗脫液進行酶活性、蛋白質濃度、聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量的基本性質分析測定。

4．DEAE－纖維素的處理及裝柱

（1）處理

本實驗采用的是DEAE－纖維素DE52是弱酸型陰離子交換劑，具體處理方法為：先將DE52陰離子交換劑干粉浸泡于蒸餾水中，去除雜質；再在0.5N的HCL溶液中浸泡1－2h,再用無離子水或蒸餾水洗至pH值中性或PH4以上，并將其在抽濾漏斗中抽干；將抽干的離子交換劑浸泡在0.5N的NaOH溶液中1－2h，再用無離子水或蒸餾水將其洗至中性。

（2）裝柱

將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的柱材，輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降再層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5－2cm處，停止裝柱。層析柱上端進液口連接恒流泵，下出口連接蛋白質監測儀，待層析柱的平衡。

（3）平衡

在柱層析上樣前必須對層析柱進行平衡，所謂平衡就是將層析柱中的溶液用層析過程的緩沖液（洗脫液）置換出來，使層析柱中的緩沖系統與柱層析過程中的系統一致。其方法是：利用層析柱上端的恒流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時，層析柱達到了平衡。在本實驗中，用0.002MTris-HCL緩沖液PH7.4(內含0.0001MEDTA)，預先將DE-52柱進行平衡。

5．上樣：

將洗脫酶液上樣，用0.02MTris-HCL緩沖液pH7.4（內含0.001MEDTA）洗脫雜蛋白。

6．洗脫：

用含NaCL(0.2-0.6M)的0.02MTris-HCL緩沖液pH7.4(內含0.001MEDTA)進行梯度洗脫。

7．測定酶活性和蛋白質濃度。