Northernblot實驗方法

DNA

MOPS電泳buffer 甲醛凝膠加樣buffer EB EGFR探針 DIG SSC

水平電泳儀 制冰機 恒溫水浴箱 凝膠成像系統 EP管 移液器 Tip頭

一、RNA轉移與固定

1.  變性瓊脂糖電泳分離總RNA樣品完成后，1×MOPS buffer淋洗凝膠片刻，10×SSC中浸泡平衡凝膠30 min。

2.  按southern blot實驗中DNA轉移方法及裝置轉移總RNA至尼龍膜上（過程中注意無RNA酶操作）。

3.  1×SSC淋洗尼龍膜后濾紙吸干，夾在2層干凈濾紙中80℃烤箱烘烤2小時。

4.  RNA染色，干燥的尼龍膜先于5%冰乙酸中室溫浸泡15 min。

5.  于0.5 mol/L 乙酸鈉和0.04%亞甲藍溶液中浸泡5~10 min。

6.  去離子水淋洗膜5~10 min，可見RNA標準及28s及18 sRNA的條帶，軟鉛筆標記。

二、預雜交、雜交及顯色

1.  Washing buffer潤洗1遍（3~5 min）。

2.  100 ml blocking buffer工作液封閉30 min。

3.  100 ml antibody buffer（1：5000）孵育30 min。

4.  Washing buffer洗膜（15 min×2）。

5.  20 ml detection buffer 平衡2~5 min。

6.  將尼龍膜置于10 ml color-substrate solution 棕色瓶中，避光數min至1天（出現顏色時不要搖動）。

7.  當出現條帶時，TE-buffer洗膜（5 min×1），終止現色。

8.  照相記錄，80℃烤干，儲存。

9.  掃描計算EGFR基因擴增的倍數。

1. 避免RNA酶污染，防止RNA降解。

2. 凝膠中最好不要加入EB，以免降低雜交的效率。

3. 為降低膜雜交本底，可適當延長預雜交時間。