蛋白質磷酸化研究的相關方法節選

對于信號轉導科研來說，抗酪氨酸磷酸化抗體的出現是一個意義重大的事件。在沒有抗酪氨酸磷酸化抗體之前，蛋白質和酶的酪氨酸磷酸化只能通過非常危險的并且很費時的放射性實驗來檢測。而利用抗酪氨酸磷酸化抗體，則可以通過Western Blot或其它免疫學方法輕松地檢測到磷酸化信號。常規的檢測方法包括：用抗酪氨酸磷酸化抗體在Western Blot上檢測內源或外源表達的磷酸化蛋白。如果目標蛋白的含量較低，也可利用免疫沉淀的方法先富集發生磷酸化的酪氨酸蛋白，再檢測目標蛋白的水平。抗酪氨酸磷酸化抗體也常用于檢測在不同處理的條件下，細胞內總的酪氨酸磷酸化水平的變化情況，作為許多細胞生物現象的一個重要指標。

我們都知道如果需要檢測某一個目標蛋白的某一特定位點的磷酸化狀態，可以選用該蛋白特定位點的磷酸化特異性抗體。但由于我們研究的通常是新的磷酸化位點，或者這些蛋白特定位點的磷酸化抗體效果不夠好，我們不得不自己制備磷酸化抗體。如果大家自己制備過磷酸化抗體，就會知道磷酸化抗體的制備比一般抗體的制備更加困難，而且浪費大量寶貴時間。現在國外的科學家發現可以使用通用型的磷酸化抗體，只要巧妙的設計實驗，也可以達到同樣的檢測目的。以Yuan的文章為例，他們需要檢測BCR-ABL的磷酸化，但他們沒有特異性的磷酸化抗體。他們首先使用了抗c-ABL的抗體和蛋白G-瓊脂糖珠子來免疫沉淀富集BCR-ABL蛋白，然后再通過Western-Blot和4G10通用型酪氨酸磷酸化抗體（pan-phosphotyrosine）來鑒定BCR-ABL蛋白的酪氨酸磷酸化水平。另外一組以Clemens為首的科學家，則利用抗Dock蛋白抗體先免疫共沉淀了DACK蛋白，再用4G10酪氨酸磷酸化抗體來檢測DACK蛋白和DSH3PX1蛋白的酪氨酸磷酸化水平，通過區分這些蛋白的分子量大小，來確認相應的磷酸化條帶的蛋白身份。