一種快速有效的基因分型斑馬魚的方法（二）

Fig.1. 應用HRMA對p53zy7（p53I166T）和apchu745（apcmcr）進行點突變基因分型。A：p53I166T 錯譯突變周圍的序列。有下劃線的為引物序列，星號標注的是SNP位點。野生型產物的Tm值為79.5℃，突變型為80.9℃。B：Melting curves of the PCR products from 48 tail-clip genomic DNA samples isolated from the adult progeny from a cross of p53zy7/t heterozygotes. Following clustering analysis, the red curves denote wild-type samples, the blue curves denote mutant samples, and the black curves denote heterozygous samples.C：apchu745錯譯突變周圍的DNA序列，下劃線標注的是引物序列，星型標注的是SNP位點。野生型產物的Tm值是80.9℃，突變的為82.0℃。D：Melting curves of the PCR products from 48 embryonic DNA samples generated by crossing a apchu745/t fish to apchu745/t fish. Following clustering analysis, the red curves denote wild-type samples, the blue
curves denote mutant samples, and the black curves denote heterozygous samples.

      p53基因型（12野生型：24雜合子：12突變型）和APC基因型（11野生型：25雜合子：12突變型）符合孟德爾的1:2:1的比率。此外，通過對p53的24個樣品以及APC的24個樣品進行測序，也驗證了HRMA的結果的準確性是100%。

缺失檢測
    除了SNP的檢測，我們還想評估是否HRMA可以提供斑馬魚小缺失的基因分型。斑馬魚突變體的bap28的第2外顯子有5個堿基對的缺失（Azuma et al.,2006）。在缺失的側翼設計引物，結果產生46bp的野生型產物和41bp的突變產物，二者的Tm值有1.6℃的差異（表2A）。分析48個DNA樣品，每一個代表一個雜合—雜合的胚胎，產生了三種不同的溶解曲線（表2B）。在這個分析中，較少的純合突變產物的Tm值較低，雜合子表現出中間的Tm值產物和異源雙鏈的產物。和p53以及APC的基因分型相似，BAP28的基因型（12野生型：25雜合子：11純合突變）的比符合孟德爾的1:2:1的遺傳比率，而且24個不同的基因型都通過測序進行了驗證。

Fig.2. 通過溶解曲線進行bap28突變小的缺失的基因分型。A：bap28缺失突變周圍的DNA序列。下劃線標注的是引物序列，虛線標注的是缺失。野生型產物的Tm值是76.8℃，突變型為75.2℃。B：從bap28y75/+雜合子得到的48個晶胚的PCR產物的溶解曲線。聚類后，紅色曲線表示野生型樣本，藍色曲線表示突變型樣本，黑色為雜合樣本。

轉錄病毒插入檢測
       斑馬魚的插入誘變是一種常見的也是一種有效的研究基因打斷的方法（Golling et al., 2002; Balciunas and Ekker,2005）。我們想設計一種方法驗證HRMA是否可以用于斑馬魚的特異性插入的基因分型。該突變系hi821a（Amsterdam et al., 2004）在wdr43基因的第二內含子有一個逆轉錄病毒的插入（表3A）。設計引物產生一個小的產物，用Tm值來區分野生型和突變的等位基因（表3B）。分析插入突變的引物設計比點突變的引物設計更加靈活；目的是設計的PCR產物有更大的Tm的差異。理想情況下，臨近插入位點的引物都可以用于PCR產物，盡量減小兩個產物的同源序列。對于hi821a等位基因，正向引物（插入位點在基因內區2,50）包括突變和野生型等位基因。引物只針對野生型和插入突變設計，因此，產物有不同的大小和不同的溶解溫度。對于hi821a位點，野生型等位基因內含子2的反向引物，在插入位點30，插入突變的反向引物接近逆轉錄病毒LTR的50末端（表3A）。因此，純合野生型或突變都只有一個產物和一個Tm值（表3C）。雖然引物A和B或A和C2在理論上都能擴增得到突變等位基因的產物，大片段的產物（7+ KB）隨著延伸時間的縮短（4sec），選擇性的擴增各產物。此外，在這種情況下，較大的產物可能被擴增，這一產物的Tm值可能會高并且易于在分析中排除。在雜合子中多有的產物都被擴增。這些產物有截然不同的溶解溫度，三種不同的基因型很容易檢測到（表3C）。值得注意的是，在分析插入突變時一個重要的步驟是PCR反應的最后一步沒有加熱到95℃，而且加了一步72℃的延伸以確保只形成同源雙鏈。Wdr43的基因分型（12野生型：24雜合子：12突變型）遵循孟德爾定律。所有24個基因型都通過PCR引物擴增野生型等位基因（583bp）和突變等位基因（230bp），然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測來驗證。