WesternBlot詳解（三）

3.抗體

T.做細胞信號傳導，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？
解答：對二抗無要求，要看你實驗條件來選擇，一般推薦用HRP標記的二抗。

U.同一公司的另外抗體用這個稀釋度做出來效果很好，所以沒做預試，怕費時間，用什么樣的稀釋度比較好呢？我用的ELL+plus試劑盒顯色。轉膜過夜，一抗孵育也是過夜的，若封閉也過夜的話就要四天才看的到結果了。
解答：不同抗體，即使是同一公司的抗體，其最佳的抗體稀釋度也是不一樣的，需要你實驗摸索。我覺得轉膜過夜好像沒有必要吧，轉膜的目的也就是將蛋白轉到膜上就行啦，何必浪費時間呢。至于具體的轉膜時間，還要看你的目的蛋白分子量的大小；轉膜的設備，是半干式，還是濕式。一抗當然可以過夜，如果你想所短Western Blot時間的話，可以增高一抗的孵育溫度，我們實驗室一般37度，兩小時就足夠了；你可以參照抗體說明書。至于一抗和二抗得稀釋度，你可以一抗1：1500；二抗1：20000試試。另外建議你洗膜時，多洗幾次，最好是在封閉；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一張好膜不容易，多盡點心吧，這樣不會浪費你的時間，只會節省你的時間！

V.免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？
解答：免疫組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構象型表位由于受蛋白空間結構限制，煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western，而如果抗體識別構象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區間。（限于單抗）

W.Western Blot 中抗體的重復應用問題
解答：抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用2－3次。稀釋后應在2－3天內使用，4度保存，避免反復凍融。

4.濾紙、膠和膜的問題

X.NC膜\ PVDF膜\ 尼龍膜怎樣鑒別？
解答：尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型；硝酸纖維素膜是目前應用最廣的一種固相支持物，價格最便宜；PVDF膜介于二者之間。
就結合能力而言：尼龍膜結合DNA和RNA能力可達480－600μg/cm2，可結合短至10bp的核酸片段；硝酸纖維素膜結合DNA和RNA能力可達80－100μg/cm2，對于200bp的核酸片段結合能力不強；PVDF膜結合DNA和RNA能力可達125－300μg/cm2。
就溫度適應性而言：尼龍膜經烘烤或紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結合DNA，結合不牢固；PVDF膜結合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。
就韌性而言：尼龍膜較強；硝酸纖維素膜較脆，易破碎；PVDF膜較強。
就重復性而言：尼龍膜可反復用于分子雜交，雜交后，探針分子可經堿變性被洗脫下來；硝酸纖維素膜不能重復使用；PVDF膜可以重復使用。

Y.在做Western Blot時，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？
解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質結合，做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。

Z.檢測磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一張膜上嗎？
解答：可以。

AA.轉膜后經麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端（即點樣空的一側）的轉膜好象不是很好，為什么？
解答：這是正常的，大分子的蛋白轉移的慢， 你延長轉移時間和電流，大分子一端就會好的多，但是小分子的就有可能會變淡。

BB.我想問您裂解細胞用三去污裂解法，還是用上樣緩沖液？
解答：用上樣緩沖液，這樣有幾個好處，可以提取總蛋白，同時又可以讓磷酸化酶失活。

CC.采用tank system有什么講究？
解答：建議低電壓，長時間，（一般tank System 用衡壓好點），如 28V 14－16hrs。

DD.做HSP WESTEN定量，同樣的抗體免疫組化能做出，而WESTEN卻不能？
解答：這多半是抗體的問題，要看抗體的說明，是否能做Western Blot和IHC。

EE.膜一般要如何處理？
解答：一般用甲醇泡泡就可以了。

FF.如果是6×8轉印膜，要加多少一抗？
解答：一抗的稀釋度是有說明的，根據你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育體積一般最少為3－5ml。

GG.上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達到最佳效果。
解答：無要求。

HH.跑電泳的時候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對嗎？
解答：沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸發了。過夜時拿保鮮膜包起來，在里面加點水保持濕度就可以了。如果過夜，膠里的水分被蒸發，采用保鮮膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑，避免找問題麻煩。脫色液中甲醇的含量太高也會造成膠縮。

II.膜、濾紙、膠大小有何講究？
解答：如果是用的是半干轉，順序為：陰極－》濾紙－》膠－》膜－》濾紙。濾紙的長寬分別比膠小1－2mm，而膜的長寬分別比膠大1－2mm。絕對禁忌：上下兩層濾紙因為過大而相互接觸，這樣會短路，電流不會通過膠和濾紙。

JJ.蛋白質的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？
解答：這么廣的分布不好轉移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉，12％SDS-PAge， 濕轉36V ， 3－5hrs就可以了， 可以根據你實驗室的經驗調節；170kd 用7%SDS－page， 48V 10hrs－16hrs。

KK.不能很好地將大分子量蛋白轉移到膜上， 轉移效率低怎么樣解決？
解答：可以考慮：轉移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度）(優化的轉移緩沖液，可以參考《蛋白質技術手冊》)，因為甲醇可降低蛋白質洗脫效率，但可增加蛋白質和NC膜的結合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質可延長轉移時間；轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉移效率；用優質的轉移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯；低濃度膠，如低至6％。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉移電壓／電流；增加轉移時間。

LL.如何選擇最合適的蛋白雜交膜？
解答：蛋白質印跡雜交是分子生物學實驗中極為常用的一門技術。選擇質量上層、合乎要求、方便適用的雜交膜是決定這項實驗成敗的重要環節。根據雜交方案、被轉移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我們要量體裁衣，從雜交膜的材質、孔徑和規格上都要做出合理的選擇。
硝酸纖維素膜：硝酸纖維素膜是蛋白印跡實驗的標準固相支持物。在低離子轉移緩沖液的環境下，大多數帶負電荷的蛋白質會與硝酸纖維素膜發生疏水作用而高親和力的結合在一起，雖然這其中的機制還不是十分清楚，但由于硝酸纖維素膜的這個特性，而且易于封閉非特異性結合，從而得到了廣泛的應用。在非離子型的去污劑作用下，結合的蛋白還可以被洗脫下來。根據被轉移的蛋白分子量大小，要選擇不同孔徑的硝酸纖維素膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結合就越牢固。但是膜孔徑如果小于0.1mm，蛋白的轉移就很難進行了。因此，我們通常用0.45μm和0.2μm兩種規格的硝酸纖維素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果用0.45μm的膜就會發生“Blowthroμgh”的現象。從膜的質地上來看，最重要的指標就是單位面積上能夠結合的蛋白的量。硝酸纖維素膜的結合能力主要與膜的硝酸纖維素的純度有關，市場上有些硝酸纖維素膜通常會還有大量的醋酸纖維素，因而降低了蛋白的結合量。S&S公司采用的是100%純度的硝酸纖維素，保證了最大的蛋白結合量，可達80-150μg/cm2。由于100%的純度，因而也大大減少了非特異性的結合，降低雜交背景，無需高嚴謹度的洗脫步驟。其次，膜的強度和韌性也是需要考慮的因素。常規的硝酸纖維素膜比較脆，漂洗一兩次就會破損，不能反復使用。
PVDF轉移膜：PVDF是一種高強度、耐腐蝕的物質，通常是用來制造水管的。PVDF膜可以結合蛋白質，而且可以分離小片段的蛋白質，最初是將它用于蛋白質的序列測定，因為硝酸纖維素膜在Edman試劑中會降解，所以就尋找了PDVF作為替代品，雖然PDVF膜結合蛋白的效率沒有硝酸纖維素膜高，但由于它的穩定、耐腐蝕使它成為蛋白測序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜與硝酸纖維素膜一樣，可以進行各種染色和化學發光檢測，也有很廣的適用范圍。這種PVDF膜，靈敏度、分辨率和蛋白親和力在精細工藝下比常規的膜都要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇進行浸泡飽和1-5秒鐘。
離子交換型轉移膜：硝酸纖維素和PVDF膜是靠疏水作用結合蛋白的，還有一類膜是根據離子交換的方式結合生物大分子的。由DEAE（二乙氨乙基）修飾的纖維素制成的DEAE陰離子交換膜同樣可以 作為蛋白質印跡的固相支持物。DEAE可以有效的結合陰離子基團，包括那些高于其等電點的蛋白質。在pH10以下，DEAE基團都能帶電荷，在低離子強度的轉移液中結合蛋白分子。其最適的pH環境為5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血紅蛋白的研究。這種0.45μm孔徑的DEAE膜，除了可以做Western Blotting外，還可以用于核酸結合研究。