2 用阿糖胞苷微核實驗檢測人淋巴細胞 (V G 1 期 DNA 剪切修復損傷的方法
在對暴露于各種遺傳毒物的人 G 。期淋巴細胞的 M N 進行檢測后發現，對于主要引起堿基損傷和 DNA 加合物而不是 DNA 鏈斷裂或者紡錘體損傷的化學物質和紫外輻射而言， MN 的形成與細胞毒性相比明顯程度較低（2 1 ) 。 我們猜測這可能是由于對損傷的有效修復，或者未修復的損傷位點在一輪 DNA 合成后不會形成 DNA 雙鍵斷裂。因此 ，我們推測用阿糖胞苷（ARA) 抑制剪切修復會使堿基損傷轉化為單鏈斷裂繼而在DNA 合成后變成雙鍵斷裂，導致無著絲點片段的產生并將在一個分裂周期內以 MN 的形 式 出 現（21， 31)。
（1）根據這一概念（ 圖 8)，我們在淋巴細胞培養的第一個 16 h 內（ D N A 合成前）加人 A R A (1 ug/m L 培養液）的確可增高紫外照射或 M N U 處理 后 M N 的形成(10 倍或更高）。而在 X 射線暴露后加人 A R A 引起的 M N 數量變化僅為 1. 8 倍 ，因為 X 射線引起的 D N A 加合物或堿基損傷與 D N A 鏈的斷裂相比較少。這種方法已用于判定可引起剪切修復的殺蟲劑，來區分誘導或者不誘導剪切修復的遺傳毒物。
（2） A R A 實驗是對 C B M N 實驗重要的補充，特別是當觀察到強烈的細胞毒性作用和較弱的 M N 產生時更需要做 A R A 。
（3）只有經過 C B M N 實驗才能用 A R A 方法準確檢測 D N A 剪切修復損傷，這是因為（a) 只有在核分裂完成的情況下才發生 D N A 剪切修復損傷向 M N 轉變;(b) A R A 的加入可能引起細胞分裂動力學的改變，若沒有 Cyt B 則可能在 M N實驗中產生干擾結果。
（4） A R A 抑 制 D N A 聚合酶，因此可能導致細胞在進行 D N A 復制合成時產生 D N A雙鏈斷裂。因此，這種方法僅在 P H A 刺激的 G 。期淋巴細胞，在 G 1 期、 S 期前暴露于 A R A 才可以，因為剪切修復通常在 G 1 期被激活。
（5） 實際操作中這意味著細胞在 P H A 刺激后的 16?20 h 內加入 A R A ，之后洗細胞去除 A R A ，在含有脫氧胞嘧啶的培養液中培養，逆 轉 A R A 對 D N A 聚合酶的抑制。
（6）以上步驟后進行標準的 C B M N (如前所述）。更詳細的流程和典型結果可在 Fenech 和 Nexille ( 2 1 ) 及 Surrales 等（3 2 ) 的文章中找到。
3 其他細胞培養體系的 CBMN 實驗
3.1 淋 巴 細 胞 的 全 血 細 胞 培 養
（1）用全血培養也可以進行人淋巴細胞的 C B M N 實驗。
（2） —般 0 ?4?0 ?5 m L 的全血加人 4. 5 m L 的 培 養 液（如 R P M I 1640)，含有胎牛血清、谷氨酸、抗生素和 P H A 。
（3）在 P H A 刺激后 44 h 加人 Cyt B 。全血細胞培養中推薦的 Cyt B 最優濃度為 6 u g/m L (33)。
(4)加入 Cyt B 后 28 h 收集雙核淋巴細胞，過程如下：
a. 300 g離心 5 min 收集細胞，棄上清。
b. 用 7ml 4℃預冷的 0.075mol/L KCI低滲處理以裂解紅細胞， 300 g離心 8m i n
C . 棄 上 清 ，加 人 5 m L 甲醇- 乙 酸（ 3 : 1 ) 固 定 液（ 必 須 一 邊 搖 晃 一 邊 加 人 固 定液 以 防 止 塊 狀 物 形 成 。）
d. 然后以 300 g 離心 8 min, 用固定液繼續洗兩遍。
e. 輕輕重懸細胞，將重懸液滴在玻片上晾干。
此外也可以用 Ficoll 梯度液從全血細胞培養中直接分離雙核淋巴細胞，然后在固定和染色前通過離心轉移細胞至玻片，這種方法會避免低滲處理，以更好保留細胞質。
(5) 用內含 1 0 % 吉姆薩染液的 0.1 m 〇 l/L 磷酸鉀緩沖溶液（p H I 3 ) 染色，用于光鏡下使用。或者用吖啶橙（含 l O ug/m L 的 0. l m o l /L 憐酸緩沖溶液， pH 6. 9,用于熒光顯微鏡下使用）。
3.2 鼠 淋 巴 細 胞 培 養
（1）從脾臟或外周血中分離淋巴細胞，根據 Fenech 等的描述培養（34)。
（2）因為鼠的淋巴細胞比人淋巴細胞的分裂周期短，因此需要在分裂素刺激后 i8 h內加入 C y t B , 并在 20 h 后收集細胞。根據培養條件的不同，甚至可以在分裂素刺激后 72 h 后得到較好的雙核細胞比例
3.3 其他原代細胞培養包括腫瘤細胞培養
CBMN 實驗可用于其他細胞類型來檢測 DNA 損傷，包括體外、體內或者來自體內的體外實驗。最重要的是記住以下幾點：（1）確保計數的 M N i 是在遺傳毒物作用后的第一次核分裂中產生的；（2）做預實驗以確定 Cyt B 的濃度和孵育時間，以獲得最多的阻滯在雙核期的分裂細胞（見注釋 10)。此外需要記住的是 Cyt B 可能需要 6 h 才能發揮阻滯胞質分裂的作用（未發表的數據)。
a.用建立的細胞系或者從分裂細胞群中得到的原代培養細胞系時，通常在遺傳毒物作用后立即加入 Cyt B 以得到所有進行第一次核分裂的雙核細胞—收集細胞前通常需要 24?48 h 的孵育時間，取決于細胞周期的時間。
b.貼壁細胞先要消化，再經如前處理人淋巴細胞所述的血細胞分離離心。具體方法已在核骨髓細胞（14)、肺 纖 維 細 胞（1 5 ) , 皮膚角蛋白細胞（3 6 ) 和原代腫瘤細胞培養（1 3 ) 中有介紹。
c.為了分析體內誘導的 MN, 更具操作性的方法是在將細胞從動物體內分離后置于含有 Cyt B 的細胞培養液中來阻滯分裂細胞的胞質分裂。這種方法已在多種細胞包括纖維細胞、角蛋白細胞、有核骨髓細胞等中得到成功應用。
4 胞質分裂阻滯或不阻滯的細胞系或培養腫瘤細胞中的微核實驗
（1）關于用于積聚雙核細胞的 Cyt B 是否會影響 M N 的表達還有爭議（28)。正常細胞的研究沒有發現 Cyt B 可誘 導 M N i ; 在通常用于阻滯胞質分裂的濃度下， CytB 也未顯示有引起 M N 出 現 頻 率 增 多 的 劑 量 效 應 （1 〇 , 37-39)。最近研究表明在胞質分裂阻滯的 B N 細胞中由紡錘絲毒物引起的 M N 表達可能比預期的少。因為兩極之間縮短的距離會增加滯后的染色體片段或者整個染色體回到核內的幾率。但 是 ，這并不影響 C B M N 實 驗 的 有 效 性 （40)。
（2）越來越多的人將眼光投入到開發不使用 Cyt B 的體外 M N 實驗中，以減小 Cyt B的影響，但是由于缺乏細胞分裂動力學對照很可能產生假陰性（如抑制核分裂會 妨 礙 M N 的表達）。
（3）雖然缺少普通細胞 CBMN 實驗可造成假陽性結果的證據，但已有很多證據表明不考慮核分裂阻滯的 M N 實驗會引起假陰性結果，或者低估人淋巴細胞中的MN (10, 11， 41)，不 用 Cyt B 的 M N 實驗的缺陷在圖 9 中舉例說明。
（4） 盡管如此，近期研究比較了用 Cyt B 或 不 用 Cyt B 的 M N 實驗后，認為如果細胞生長狀態很好且培養和核分裂合適的情況下，在檢測強斷裂劑時，無 Cyt B的條件下可得到相似的 CBMN 和 M N 結 果 （42, 43)。
（5） M N 表達的數學模型預測 （1 ) 在雙核細胞中 M N 計數是計算 M N 頻率最可靠的方 式 （2 ) 當核分裂被測試的化學試劑顯著阻滯或培養條件下無法得到理想的分裂細胞時，在 不 用 胞 質 分 裂 阻 滯 的 單 核 細 胞 中 M N 計 數 會 引 起 假 陰 性 結 果(44)
（6）因此，用不經 Cyt B 處理的單核細胞得到的 M N 頻率不能用作實驗的結論性結果 ，需通過 CBMN 實驗的陰性結果來進一步證實。
5 測量微核和不分裂中的染色體丟失的分子技術
要充分利用 C B M N 實驗的優勢就需要區分來源于整個染色體的 M N i ，以及來源于無著絲點片段的 M N i 。這能通過針對著絲點 D N A 的特異性探針或者針對聚集在活躍的染色體著絲點區域的著絲點蛋白的特異性抗體來實現。對于人類細胞或其他染色體大小為異質的細胞用 M N 的大小來做判斷并不合適，因為小 M N 可能包含大染色體的片段，或者一整個小染色體。最簡單且經濟的方法是用抗著絲點抗體 （45)，但這種方法不能區分特定染色體，并且可能無法探測由不活躍中心粒的著絲點蛋白缺失而發生的染色體丟 失 （46)。用 原 位 雜 交（I S H ) 確定中心粒區域雖然費錢費力但它有更好的特異性;例如 ，可以利用針對特定染色體的著絲點探針探測在雙核細胞中的不分裂事件（在子核中同源染色體的不平等分離）（17)。本章只介紹著絲點蛋白抗體法。對 于 用 1S H 探測中 心 粒 區 域 請 參 考 Farooqi ( 1 7 ) ， 以 及 H ando ( 1 8 ) 、 Ehajouji ( 2 3 、 4 7 ) 、 Schuler
( 2 5 ) 等的文獻。用不同的技術預期可檢測到的各種結果如圖 1 〇所本。
1 CBMN 實 驗 中 M N i 的 著 絲 點 檢 測
5.1 玻片準備
（1） 用同標準 C B M N 實驗方法收集 B N 細胞，用血細胞離心器轉移至玻片，空氣干燥 5m i n , 用甲醛固定 IOmin, 再次空氣干燥。
（2） 在此步驟，玻片可以立即使用或者放在密封的干燥盒子里儲藏在液氮的氣相部分 ，最長儲存期限為 3 個月。
（3）要檢測儲藏的玻片上的著絲點蛋白時將玻片從液氮中移出，放在密封的盒內室溫下平衡。
5.1.2 著絲點蛋白檢測
（1）抗著絲點蛋白血清可以商業購買或者從有硬皮病 C R E S T 亞型病人血清的免疫診所 獲 得 （48)。用后者血清需要獲得人類倫理方面的認可并且得到捐獻病人的同意。
（2） 血清需要在培養細胞的中期分裂細胞涂片上，用 F I T C 標記的兔抗人二抗在熒光顯微鏡下觀察檢測。只有特異地與中期染色體著絲點反應的血清才能用于后期實驗。
（3）用 F I T C 標記的二抗檢測著絲點蛋白雖然較為直接但需要熒光顯微鏡，并且為非永久制備的玻片。這一突光技術在它處已有詳細描述 （45)。另一種可選方法是用免疫過氧化物酶染色，這可獲得永久保存的玻片 （49)，這種方法作為常規檢測更實用，將在下一段中詳細描述。
（4）在熒光過氧化物方法中，將固定好的玻片置于裝有用 Tris& 緩 沖 液（P H 7. 6,6. O g Tris 堿/L 鹽溶液）按 1 : 4 0 比例稀釋的抗著絲點蛋白一抗的潮濕小室內，20℃孵育過夜。
（5）用稀釋的正常人血清制備陰性對照。
（6） 第二天用同樣的稀釋抗體的 Tris 鹽緩沖液浸沒玻片 30 s 以沖洗玻片
（7）不用干燥，浙干玻片，用過氧物酶標記的兔抗人 I g G 抗體孵育 3 h 。
（8）再次瀝干玻片，準備過氧物酶組化反應。
（9）免疫組化法中可給出最好對比的是能產生黑色沉淀的咪唑氯化鎳改進的標準D A B 反 應 （50, 51)。
（10）在使用前配制 D A B 反應物，然后用 0.22 的濾紙過濾，以防止非特異的沉淀物出現在玻片上。
（11）玻片需要成批染色，包括陰性對照。
（12）在 20°C 反 應 Imin, 然后停止染色，將玻片放在水里漂洗。
（13）然后風干玻片，用核染料中性紅 （0 . 1 % 水溶液）染 色 約 30s, 用水漂洗，風干，以制備永久玻片。
5.1.3 計 數 流 程
（1）只限于在每個核內至少含有 20 個著絲點的雙核細胞中計數 M N i 著絲點的情況。
（2）按照是否含有著絲點將至少 100 個 M N i 進行分類，并且要注明每個 M N 含有的著絲點數。
（3）用以下公式計算含著絲點的 M N i 的最終比值：（朽一 P c ) / (l—P c )， P c 指玻片上正常血清處理后過氧化物酶反應為陽性的 M N i 的比例， P s 指玻片上抗著絲點蛋白血清處理后過氧化物酶反應為陽性的 M N i 的比例。
6 體外化學敏感性測試的處理流程
（1）理想狀態下每一種化學物質都需在細胞周期的各種時期測試其潛在的遺傳毒性。因為在收集時人外周血淋巴細胞都處于 G fl 期，對于評價此階段的損傷而言較為理想。
（2） 然而，由于在 S 期 、 G 2 期和 M 期的細胞對于遺傳毒性的作用更敏感，因此最好在大多數細胞分裂時將它們暴露于毒物中。因為 M N 表達需要一次核分裂的完成，所以在處理細胞和收集細胞之間需要有充足時間保證分裂的完成。
（3） G 。期處理的人外周血細胞需要盡早收集雙核細胞，并且在盡量長的時間內收集以確保甚至是減數分裂延遲的細胞也能被觀察到。經典做法是在 44 h 后加入 CytB ，在 72 h 后收集細胞，間隔的時間應該足夠滿足上述條件。但是也可用下述方法使分裂較晚的細胞能被觀察到： 24 h 后加人 C y t B , 96 h 后收集細胞。
（4） 如果需要在 S 、 & 和 M 期進行處理，比如腫瘤細胞，需在細胞呈指數增長時加入化學物質，之后較短時間內加入 Cyt B 積累分裂細胞，再根據要檢測的細胞周期在 6?24 h 后收集細胞。
（5）早期收集的雙核細胞多是處于 G 2 期或者 S 期暴露的細胞，而在晚些時候收集的雙核細胞包括在各期暴露的細胞。因此相對于 Cyt B 加入時間而言，收集細胞的時間會影響觀察到的細胞類型。
（6） 表 2 是 C B M N 實驗檢測遺傳毒性的常規步驟。
（7）在測試新化學物質時可選擇像 S9 混合物這樣的代謝激活系統。但這可能會縮短暴露的時間，因為 S9 對靶細胞可能有細胞毒性作用。較好的方法是選擇有代謝活性的細胞，例如基因修飾的 M C L -5 細 胞 （52)。
注意事項
（1）在我們進行 CBMN 實驗過程中，最容易產生問題的是在玻片的制備和染色環節 ，因為計數結果的好壞依賴于制片的質量。主要注意事項：（a） 在將細胞置于玻片前應輕輕吹打，避免細胞結塊；
（b）細胞密度適中，這樣才容易辨認細胞質邊界；
（c） 在染色所有玻片前先試染一張，以確定染色合適。
（2）要做重復以確保結果可信，同時也可計算組內重復標準差數據。細胞遺傳毒性實驗需要滿足嚴格的數據分析標準，如 果 C V 值大 于 1 0 % 就應剔出。由于是肉眼計數觀察實驗，較大的標準差是可以接受的。根據我們的經驗和國際實驗室間計數比較的結果，基線數據 C V s 大于 4 0 % ，則不能接受；對于暴露于放射條件下培養，每 1000 個 BN 細胞中有大于 100 個 M N 時， C V s 應小于 2 0 % 。
（3）不熟練操作者（如學生和新技術員）的計數不可靠，除非他們在計數標準對照玻片時 C V 值達到可被接受的程度（不大于 40% ) 。
（4）不同計數人員間的差異是造成 M N 實驗差異的主要原因之一 （71)。此，在一項研究中使用同一個技術員是很有必要的，最好有兩名技術員，用如 圖 2 所示的同樣方法對重復組進行計數。另一方法是用有「低」、「中」、「高」 M N 頻率的標準片對計數員進行校正。每一個計數員對標準玻片的計數可被用來計算一個校正值。這種方法雖然仍在完善中，但由于它考慮了在同一個實驗室或實驗室之 間計數員的視覺差異，從而也是值得重視的。
（5） 另一造成計數員和實驗室間差異的重要影響因素是顯微鏡的質量和鏡頭。根據我們的經驗，統計核質橋受到顯微鏡的影響，因為細小的核質橋會被質量較差的鏡頭忽 略。需要注意的是計數員應避免在實驗中變換顯微鏡，并且實驗室負責人應統一顯微鏡的鏡頭，并將其升級至一個較高的水平。我們推薦使用可以提供優質清晰度、 圖像對比度和平整度的系統。系統應有放大 1000 倍的能力。
（6）常見問題之一是確定在 CBMN 實驗中 BN 細胞的數量。雖然記數從 500 到 2000個 BN 細胞都有過報道，被認可的做法是每次處理或時間點計數不少于 1000 個BN 細胞。另一種方法是計算 B N 細胞數直到出現固定數量的微核（例 如 4 5 個微核)。后者的優點是當 MNi 數量較少時需要較多的 BN 細胞，這樣能在不同處理之間保持統計效力。缺點是當 M N 頻率較低時可能需要計數超過 2000 個細胞。我們的實驗顯示每個重復統計 1000 個 BN 細胞可以得到可信結果。
（7）在觀察玻片時首先計數單核細胞、雙核、多核、凋亡和壞死細胞頻率來確定 ND1 和NDCI。 然后計算雙核細胞中的微核、核質橋和核芽數量以確定遺傳損傷的比例。