NorthernBlot

試劑、試劑盒 20XMOPS 緩沖液 20XSSC 50XDenhardt 液 雜交液 10%SDS

儀器、耗材 水平電泳裝置 水浴 硝酸纖維素膜或尼龍膜 3 MM 濾紙 紫外交聯儀 雜交管 雜交爐 [32P] 標記的 DNA 或 RNA 探針

實驗步驟

一、材料與設備

1) 水平電泳裝置

2) 水浴

3) 硝酸纖維素膜或尼龍膜

4)3 MM 濾紙

5) 紫外交聯儀

6) 雜交管

7) 雜交爐

8）[32P] 標記的 DNA 或 RNA 探針

9)20XMOPS 緩沖液:4l.86 gMOPS,8 g 乙酸鈉，72 gEDTA，加 DEPC 水至 300 ml，調 pH 至 7.0

10)20XSSC(3mol/LNaCl，0.3mol/L 檸檬酸鈉，PH7.0):175 gNaCl,88 g 檸檬酸三鈉?2 H2O，加水 800 ml，用 l0mol/LNaOH 調 pH 至 7,0, 定容至 l000ml

11）50XDenhardt 液：5 gFienll(type100),5 g 聚乙酰吡咯烷酮 (pvp)，5 g 牛血清蛋白，加 DEPC 水至 500 ml,-20℃ 保存

12) 雜交液：50%(m/V）甲酰胺（去離子），5XSSC1%(m/V)SDS，5XDenhardt 溶液 100ug/ml,tRNA 或鮭精 DNA

13)10%SDS

二、操作方法

(一）通過毛細管原理轉移 RNA 至膜上

1) 通過變性瓊脂糖凝膠電泳時總 RNA 或 poly(A)+RNA 進行分離

2) 電泳后，將膠管于 DEPC 水配制的 O.O5mol/LNaOH 浸泡 30 min;DEPC 處理的水漂洗,10 倍體積 20XSSC 浸泡 45 min.

3) 將硝酸纖維素膜和濾紙用 20XSSC 浸泡 10 min 不要直接用手或臟手接觸濾膜

4) 按下圖 5.1 所不，依次放置濾紙、凝膠，硝酸纖維素膜，濾紙、紙巾、玻璃板和 500 g 的重物，并在凝膠的四周用窄的封門膜條環繞，利用紙虹吸轉移過夜，其間換紙巾 2?3 次

5) 用 1XSSC 淋洗硝酸纖維素膜并晾干，在紫外交聯儀中用短波紫外線照射或真空爐于 80℃ 烘烤 lOmin，使 RNA 固定于膜上。可用保鮮膜將濾膜包裹起來存于 4℃ 備用或立即使用

(二）探針的標記

用隨機引物標記試劑食對 DNA 探針逬行標記。并用柱子如 ElmipD 柱(Schleicher&Schncl1、Keene、NH) 對其進行純化

(三）預雜交和雜交

1) 用 1XSSC 緩沖液將膜浸濕，置于雜交瓶中

2) 加入雜交液，42℃ 預雜交 8?12 h 以封閉非特異性結合位點。

3) 替換新的雜交液，將已標記好的探針煮沸變性 lOmin，取出后立即置冰浴 lOmin，將變性探針加入新的雜交液中，42℃ 雜交 20 h

(四）洗膜和檢測

1) 雜交完畢后，迅速加入大量 2XSSC/0.5%SDS 室溫下振蕩洗膜 5 min, 再用 IXSSC/0.1%SDS 室溫下繼續振蕩漂洗 15 min; 換用大量 0.1XSSC/0.1%SDS37C 漂洗45mi n,接著換新鮮的同一溶液，65℃ 繼續洗滌 45 min。

2) 室溫下，雜交膜用 0.1XSSC 稍稍漂洗，然后置于濾紙上吸去膜上液體，用保鮮膜包好，置暗盒中一 70℃ 放射自顯影 1?2 天。

(五）濾膜的再次使用

將尼龍膜浸泡于 50% 甲酰胺、0,1%SSC、0.1%SDS 溶液中，68℃ 保溫 1?2 h，然后室溫下用 0.1XSSC 溶液漂洗，用濾紙吸去大部分液體，再次用保鮮膜包裹，放射自顯影，檢查探針是古已被洗掉，如已冼盡，則按上述預雜交、雜交、洗膜的流程進行第二次雜交，只是這一次換成微球蛋白的探針。

注意事項

1) 經典毛細管轉移法是一種簡單可靠的方法，而且由此得出的結果可與任何其他特別設計的轉移裝置所獲得的結果相媲美。

2) 在 Northern 印跡屮，高保真的 RNA 樣品和探針是關鍵。在制備 RNA、電泳、雜交過程屮，為避免 RNA 降解失活，全部試劑和器皿均應滅活 RNA 酶，操作過程中應戴手套和避免說話。

3) 硝酸纖維素膜要充分浸濕。

4) 在 RNA 轉移至硝酸纖維素膜之后對 RNA 進行染色。將干燥的濾膜浸入 5% 冰乙酸中，于室溫浸泡 15 min，再將濾膜轉至 0.5mul/L 乙酸鈉（pH5.2) 和 0.04% 亞甲藍溶液中，于室溫浸泡 5?10 min, 用水浸洗濾膜 5Omin，可見 RNA 標準分子質量參照物帶形銳利，總 Poly(A)-mRMA 為一模糊帶形，范圍為 500?5000bp,mRNA 的平均大小約為 2kb

5) 通常, 用 [32P] 標記探針進行的雜交仍是 Northern 印跡的最敏感的方法。非同位素標記法可用于較高表達的 RNA 的檢測或定量。探針分子質量在 lkb 左右時雜交效果最佳

6) 提高漂洗的嚴格性可明顯提高雜交特異性。嚴格的漂洗意味著低鹽濃度（SSC)和高雜交溫度然而在高嚴格條件下特異性的結合會下降

7) 如果需要額外漂洗或再雜交，濾膜必須保持濕潤

8) 雜交和漂洗應在低于 Tm5-15℃ 的條件下進行操作

9) 設計比較性試驗時，應考慮 RNA 內參照的設置，通常可用β-微球蛋白的探針作為哺乳動物細胞的 RNA 內參照

10) 通常用 10?20ugRNA 進行 Northernblot 雜交，可以檢測占 mRNA 總量 0.1% 以上的高豐度 mRNA, 如果待測 mRNA 含量極微，每個泳道應加 0.5?3ugPoly(A)-RNA。