雙向電泳實驗

試劑、試劑盒 尿素去污劑

儀器、耗材 聚丙烯酰胺凝膠

實驗步驟

一、第一向

1. 等電聚焦凝膠的準備

雙向電泳通常用聚丙烯酰胺凝膠作介質，但需含有 8 mol/L 尿素、0.5%~2% 非離子或兩性離子去污劑。為了增加樣品的可溶性，可加 0.5% CHAPS。在第一向電泳中，最重要的是用載體兩性電解質建立 pH 梯度。如 “載體兩性電解質 pH 梯度等電聚焦” 所述混合不同 pH 范圍的載體兩性電解質或使用預混合的載體兩性電解質可以增加第一向電泳的分辨率。

O'Farrell 的 ISO-DALT 系統的第一向是用管狀凝膠，雖然也能得到高分辨，且上樣量大，對鹽的耐受量也大，但會由于電內滲效應丟失堿性蛋白。平板等電聚焦時電極只與凝膠的邊緣接觸，電解體積小，陰極漂移小。相對來說不易丟失蛋白。將薄層凝膠聚合在支持膜上更能得到好的結果。

含有尿素、離子去污劑和載體兩性電解質的凝膠聚合方法請參閱 “載體兩性電解質 pH 梯度等電聚焦”。

2. 樣品準備和加樣

可溶蛋白的樣品，如體液，細胞和組織的萃取液能直接用于雙向電泳，但應稀釋到合適的濃度。固體樣品，如組織，細胞或在組織培養液中的細胞，加樣前應先破碎，研磨和溶解。通常使用的溶解液是 O'Farrell 提出的 9 mol/L 尿素和 2% ( W/V）非離子去污劑（NP-40 或 Triton X-100 )。但對有些蛋白，如組蛋白、核糖體蛋白和膜蛋白的溶解仍然是困難的，必須做適當處理。

使用管狀凝膠和垂直平板凝膠時，樣品被加在濃縮膠的頂上，靠近電極容易引起蛋白的變化，水平電泳可加在凝膠的合適位置。有關樣品的溶解、加樣方法、加樣量等請參閱 “載體兩性電解質 pH 梯度等電聚焦”。

3. 等電聚焦

等電聚焦的方法同 “載體兩性電解質 pH 梯度等電聚焦”。由于雙向電泳用的第一向凝膠和樣品中含有尿素和去污劑，聚焦時的溫度應稍高于通常用的溫度，如 15~20℃，以防止尿素結晶。如在凝膠上覆蓋一層膜，也可以防止尿素結晶，并克服大氣中二氧化碳的影響。由于尿素使蛋白變性，會增加蛋白分子的直徑。鑒于以上一些原因， 應使用新鮮樣品和凝膠，并適當降低電壓和增加聚焦時間。

4. pH 梯度的測定

如采用表面電極進行測量，由于尿素和溫度對 pH 的影響，應使用校正因子，請參閱 “載體兩性電解質 pH 梯度等電聚焦” 的有關章節。

另一種方法是用蛋白標準作為內標準。常用的等電點蛋白標準不能用于雙向分析，因為電泳條件不同。雙向電泳的標準是選擇一些合適的蛋白，在有尿素時加熱不同時間得到的，最終在雙向凝膠上呈現以一定 pH 單位間隔排列的點，點的數目取決于蛋白質氨基酸的組成。

5. 平衡

第二向 SDS 電泳前，將等電聚焦凝膠按樣品泳道剪成膠條，用含有 SDS，在還原條件下的 pH 8.8 Tris 緩沖液平衡。目的是使蛋白質分子與 SDS 和還原試劑充分相互作用，解聚蛋白質分子，并與 SDS 結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS 膠束，以確保第二向的遷移。平衡時間是很重要的因素。柱狀膠約需 30~40 分鐘，薄層膠（0.5~1 mm ) 約需 5~10 分鐘，超薄膠只需 1~2 分鐘。

二、第二向

1. SDS 凝膠的準備

請參閱 “SDS 聚丙酰胺凝膠電泳” 各種不連續 SDS 凝膠灌注方法。

2. 二向間的轉移

平衡后的等電聚焦凝膠條與 SDS 凝膠的良好接觸是雙向電泳結果的保證。管狀凝膠的轉移需要用瓊脂糖密封，但瓊脂糖中的不純物在銀染時會顯現斑點。如用快速丙烯酰胺聚合的方法，聚合過程中產生的熱會使蛋白變性。

垂直平板電泳時凝膠間的轉移可以直接放置，但要防止膠條被拉長，否則蛋白帶會歪斜而使雙向電泳譜畸變。薄層水平電泳間的轉移比較容易，因為凝膠聚合在支持膜上，只要將等電聚焦凝膠的膠面向下，貼于 SDS 凝膠上，避免氣泡陷入即可。為了以后分子質量的測定，在 SDS 凝膠的一端應加分子質量蛋白標準。

3. SDS 電泳

請參閱 “SDS 聚丙酰胺凝膠電泳” SDS 電泳的方法。

4. 檢測

考馬斯亮藍染色、銀染色、熒光標記、放射自顯影等檢測方法請參閱 “常規聚丙烯酰胺凝膠電泳” 和 “SDS 聚丙酰胺凝膠電泳”。由于雙向電泳的高分辨率，分離的蛋白斑點無法用肉眼來比較和辨別，應該用凝膠掃描或攝錄系統將數據進行處理。