蛋白質濃縮和溶質的去除實驗（三）

三、透析

透析是基于分子質量大小的液相分離技術，它由透過半透膜的選擇性擴散來實現。這種技術被認為是從大分子蛋白質中去除小分子溶質的最流行方法。特別是，這種非變性的脫鹽技術允許在良性或生理條件下更換緩沖液，其影響目標蛋白質性質的風險可降到最低限度。

過去的十年里，透析的原理并沒有改變，但用于透析的技術和工具卻得到了改良。尤其 是 優 化 的 技 術 實 現 了 高 通 量（減 少 處 理 時 間 ），增 加 了 處 理 樣 品 體 積 的 靈 活 性（從1 0 uL ? 100 m L ); 改進了的透析膜形態減少了蛋白質的吸附和損失，提高了樣品處理的方便性。

通常情況下，目的緩沖液 (透析液）的體積要比蛋白質樣品的體積大若干個數量級。樣品被轉移到一個密封艙內，暴露于充當半滲透屏障的透析膜。透析膜通常具有特定的孔徑, 即截留分子質量 (M W C O )，它允許分子質量小于這一限度的分子雙向自由通過，而大分子物質 (如蛋白質) 則被截留。透析膜兩邊的緩沖液濃度梯度驅動溶質從濃度高的區域向濃度低的區域擴散 (圖 9. 1)。擴散運輸的流量可以用菲克擴散定律來描述。

有幾個方面可以影響透析產品的穩定回收, 包括緩沖液交換所需的時間、透析系統的設計以及透析膜的化學和形態學特征。完成緩沖液交換所需要的時間取決于幾個因素。可以通過提高分子穿過半透膜的固有擴散作用以減少透析過程的時間。基于前述的方程 ，物質轉運可以通過增加膜面積或溶質的流量而得到提高。當樣品體積很小時, 可以很容易的得到樣品相對于透析液的一個很大的比率。然而, 蛋白質可吸附到透析膜而導致損失。在這樣的背景下，需要評價增加膜面積或增加時間 (對于較小的膜面積) 所產生的影響。由于溶質的擴散系數隨溫度而變化，溫度升高將加快分子運動，增加內在的擴散系數 ，從而導致更快的轉運。然 而 ，升髙溫度會對樣品的穩定性產生不利的影響。由于樣品的完整性往往是最重要的，因此可能需要預先確定能保持蛋白質穩定的最高溫度。

透析系統的設計也可以決定進行有效透析的時間和產品回收的效率。溶質從樣品中穿過膜擴散進入透析液的邊界層。邊界層中溶質的濃度髙于透析液中其他部位溶質的濃度 ，從而減少跨越膜的濃度梯度，抑制擴散的進行。然而 ，可通過介導透析液的對流流動或通過不停的攪拌來減小邊界層。

當前，透 析 膜 和 透 析 管 的 機 械 設 計 使 其 可 以 對 范 圍 廣 泛 的 樣 品 量（從 10 uL ?100 mL) 進行加工處理, 其產品的損失可以忽略不計。傳統的透析管在其可使用之前要經歷復雜的準 備 。 Pierce Biotech (Rockford， IL) 提 供 的 SnakeSkin?透析管可以簡化大體積樣品的透析。這一技術的核心為褶狀的再生纖維素膜 (3. 5? 10 kDa M W CO)，便于快速 準 備 。在小體積樣品透析的情況 下 ， Pierce 提 供 了 簡 潔 的 SlideA-Lyzer?微型透析
器 (10? 100 uL ) 和透析盒（0.1? 30 m L ), 用于處理有限的小量生物樣品。 這些透析器是一 次 性的杯子，由聚丙烯和再生纖維素制成，使用標準的實驗室移液器可以很容易地移取樣品。新的設計提高了對寶貴的小量樣品的回收率。

1 濃 縮 和 親 和 結 合 的 應 用

蛋白質緩沖液交換的應用主導了透析膜的使用。然而 ，透析技術在濃縮和大分子親和結合相互作用領域的應用越來越多。

使用透析膜進行蛋白質的濃縮類似于雙水相萃取，通過使用試劑（ 如聚乙二醇、葡聚糖等聚合物) 產生一個雙相系統, 而透析膜則將這個兩相分開 (Waziri etal. ， 2004)。根據該系統的設計，蛋白質可以自由的通過膜并與沉淀劑相互作用，隨后得到濃縮，同時產品也得以回收。

這項技術被稱為平衡透析, 它也被用于在血清結合測定中對候選藥品的鑒定，研究抗原-抗體相互作用，以及評估使用其他方法無法檢測的低親和力相互作用。在平衡透析中，膜的選擇需要滿足以下條件: 所需的蛋白質或配體可以自由通過; 受體分子只能位于膜一邊 ，且不能透過。當蛋白質擴散穿過膜時，其中的一些蛋白質將結合到受體上，而有些蛋白質則仍保留在溶液中。配體穿過膜并結合到受體上的擴散作用會持續進行，直到達到平衡。
配體槽中自由配體的濃度也可以用于檢測樣品的結合特性 (Waters et al. ， 2008)。

四、超濾

超濾 (U F ) 所利用的分離機制本質上相當于透析。兩種技術都采用半滲透屏障或膜將樣品 (包含有所需的產品或溶質) 從溶液中分離開來。膜的設計允許小分子質量的溶質(如鹽) 滲過，而所需的產品則完全保留下來。超濾膜非常適用于濃縮生物制劑，因為它們可以在一個較寬的溫度范圍 (2?26°C ) 內操作，而且不涉及相變化或化學添加劑，從而最大限度地減少了不穩定生物制品的變性和/或降解。將超濾與透析區分的作用有 3 個:①
應用;②操作模式;③膜的結構。首先，透析主要用于溶質或緩沖液的交換, 而超濾則應用于緩沖液交換或產品的濃縮。其次 ，透析是通過由半透膜兩邊的濃度差所驅動的擴散傳作用而進行的，而超濾主要是由膜兩邊的壓力差所驅動的傳統的傳質而起作用的。由于使用不同的驅動力進行溶質或溶劑的轉移，用于超濾的膜的機械強度要比透析膜的大。壓力驅動的超濾膜的設計可承受超過 75 psi①的高壓力差。

一 般 情 況 下 , 有 3 種 模 型 方 法 已 被 用 于 描 述 通 過 超 濾 進 行 溶 質 轉 運 的 真 實 機 制(Denisov， 1994)。其 中 的 一 種 超 濾 轉 運 機 制 如 圖 9. 2 所 示 。由壓力 驅 動 的 液 流 促 使 溶質 和 溶 劑 向 膜 的 上 游 表 面 傳 遞 并 透 過 ，所施加 的 壓 力 差 被 稱 為 跨 膜 壓 力（△P _tm ) 。如 果 膜可 以 完 全 保 留 住 一 個 給 定 的 溶 質（如 蛋 白 質），就 如 同 通 過 超 濾 進 行 濃 縮 的 情 況 一 樣 ，C _濾出液=0, 保 留 下 的 溶 質 將 在 膜 的 上 游 表 面 積 累 ，將 導 致 膜 表 面 在 邊 界 層 厚 度 δ 內 的 濃 度增 加 。這 種 現 象 稱 為 「濃 度 極 化 “(concentration polarization)。 溶 質 在 膜 表 面 的 積 累 會 通過 幾 種 機 制 影 響 溶 劑 過 濾 通 量 (J v) 。首 先 ，積 累 的 溶 質 可 以 產 生 一 個 沿 著 膜 的 滲 透 壓 力差 ，驅 動 液 流 從 濾 液 向 原 料 或 滲 余 物 的 方 向 流 動 ，從 而 減 少 溶 劑 運 輸 的 凈 速 率 。對 通 量 的描 述 見 下 文和圖 9. 2。

總 體 而 言 ，這 些 模 型 可 以 讓 用 戶 更 好 地 了 解 超 濾 工 藝 參 數 對 溶 質 和 溶 劑 流 量 的 影 響 ，并 可 以 依 此 優 化 條 件 來 提 高 膜 的 通 量 。這 些 模 型 最 重 要 的 應 用 可 能 是 開 發 設 計 可 進 行 大規 模 濃 縮 的 超 濾 系 統 ，對 昂 貴 的 產 品 (如 用 于 疾 病 治 療 的 蛋 白 質 ) 進 行 濃 縮 ，在 此 ，濃 縮 工藝 的 生 產 力 和 回 收 率 都 是 至 關 重 要 的 。而 對 于 實 驗 室 規 模 的 超 濾 , 這 些 因 素 不 是 最 關 鍵的 ; 但 在 用 于 小 規 模 制 備 的 超 濾 系 統 的 設 計 中 應 該 考 慮 這 些 因 素 。