實驗方法原理
通過全細胞膜片技術來檢測神經元興奮性及其放電活動，是電生理實驗的基本方法。神經組織塊膜片鉗技術相對于培養細胞膜片鉗技術而言，細胞更接近原始的生理環境，細胞具有更好的生理狀態，封接后可維持更長的時間。
實驗材料 細胞
試劑、試劑盒 人工腦脊液(ACSF)消化酶濃縮液ACSF通混合氣尼龍網準備電極內液
儀器、耗材 放大器（如Multiclamp700B)數模轉換器（如Digidata1322series)顯微鏡（如OlympusBXSI)微操縱器
實驗步驟
1.大鼠以0.5ml/100g1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，背部去毛備皮，頸椎脫臼法處死。
2.迅速剪開其背部皮膚，自L5、L3處橫斷脊椎，剪開肌肉，迅速取下L5-3脊椎，并置于冰水混合狀態的氧飽和ACSF中，以上過程要求迅速，在1min之內完成，以保證神經元活性。3.仔細去除脊椎周圍肌肉組織。
4將脊椎沿矢狀面縱向剖開，將其一分為二，用游絲攝剝離脊髓，如果采用單側疼痛模型，如CCD、CCI、SNL等，需分清左右側背根神經節(DRG),其區分辦法為脊髓沿正中矢狀面剖開后其椎管直徑頭端大千尾端。
5沿脊椎連接處輕輕拼開，便可見到在椎板下面的背根神經節，仔細分離周圍硬脊膜，用游絲攝輕輕夾住背根神經節軸突束深部，將其輕輕提起，摘取L5、L3背根神經節，置于氧飽和的室溫ACSF的35mm培養皿中（注意本步驟要求實驗者動作輕柔，切忌用游絲攝直接夾取神經節，對其造成損傷）。
6在體視顯微鏡下，仔細剝除DRG周圍結締組織及被膜。
7.將組織塊及消化酶濃縮液（見前述）放入離心管中，用氧飽和的ACSF稀釋至2ml,于37℃恒溫水浴中孵育45min。
8取出組織塊，放入氧飽和室溫ACSF中，靜置1-2h后開始實驗。
9.消化后細胞在40X物鏡下如圖3-4。
10.以上步驟可用于其他組織的制備，關鍵點在于保證目的細胞的活性及盡量清除附著于細胞表面的黏連蛋白、細胞碎片等雜質，消化液的配制及消化時間可根據不同的標本進行調整。
11．選用1.4mm的硬質玻璃微管（國產毛還玻璃微管需用乙醇浸泡，超純水清洗并且超聲微波震蕩，以去除油脂和灰塵，烘干備用）。
12用乙醇燈將玻璃微管兩端輕微燒制，使其棱角變得圓鈍。
13.在P-97拉制儀上用三步法拉制出尖端直徑為1μm左右的玻璃微電極（檢驗方法為灌入電極內液后入水電阻為5-8MΩ)。
14.電極在實驗前拉制，不可過夜。
15充灌電極內液，內含玻璃毛細管的電極可用帶有合適直徑針管的注射器從尾部充灌。
16酶消化后的DRG置于循環灌流的氧飽和ACSF記錄槽中，用有尼龍網網格的"U"形鉛金絲固定，使標本完全浸于ACSF中，并保證一定的灌流速度使神經元能夠充分補給，并將液流調整平穩后，開始封接等操作。
17實驗用Olympus正置顯微鏡，用40X浸水物鏡觀察單個DRG神經元形態并進行可視封接。在高倍鏡下找到細胞(Camera處拉桿處于拉出狀態，鏡頭拉桿處千推入狀態），逐漸涸亮視野，則可見清晰的細胞圖像。紅外可視條件下，選擇表面光滑、輪廓清楚、外觀柔和、有彈性的細胞進行封接，電極尖端接觸細胞表面容易形成凹陷。而狀態較差的神經元則表面皺縮或腫脹、輪廓模糊不清、可見到細胞核。
18.將充灌好細胞內液的玻璃微電極安裝于電極夾持器上，并用螺帽固定（注意用于固定玻璃微電極的橡皮環必須與之緊密結合，不能產生漏氣，否則將影響封接）。
19.通過與電極夾持器相連的硅膠管給予電極尖端適當正壓充灌，防止玻璃微電極尖端污染。
20.通過微操作系統將玻璃微電極尖端下降至灌流液面以下。此時采用pClamp軟件的sealtest可測量玻璃微電極電阻，保證其在5-8Ω。
21電極剛入水時測試波形基線不在零位置上，必須將基線補償回零。在Multiclamp700B界面上采用Auto按鈕，如為Muiticlamp200B則需用手動調節。
22低倍物鏡下找到電極并將其置于視野中心或略偏左側。
23.將高倍鏡入水，使之處于最低狀態，逐漸將高倍鏡上抬找到電極尖端，中倍Manipulation速度下降至可見細胞輪廓，將Manipulation轉為慢速，將電極尖端位置與細胞相對位置調整好，慢速接觸，當電極尖端與細胞膜接觸時，sealtest指示Rm會有所上升，將電極進一步下壓，Rm會進一步上升。
24通過與電極夾持器相連的塑膠管向電極內稍加負壓，當細胞狀態良好時，Rm值會迅速上升，直至形成高阻封接(GΩ封接）。
25電極電容補償，使用Multiclamp700B放大器時，直接依次點擊快慢電容補償的Auto按鈕即可（圖3-5)。
26采用更大的負壓吸引，打破細胞膜，使電極內與細胞內貫通，成為全細胞膜片鉗記錄模式。此步驟容易造成封接的不穩定，需格外小心。對于初學者來說需要一個摸索過程，可采用嘴吸的方法，一般采用脈沖式負壓吸引，效果較好。一些放大器提供了"Zap"點擊破膜功能。
27串聯電阻補償。勾選"Wholecell",勾選"RsCompensation",將"RsCompensation"下的"correction"及"Prediction"上升至70%以上，同時逐漸調整''Wholecell"下的電容及電阻值，使之達到要求，見結果判讀部分（圖3-6)。
28.通過Clampex軟件設置的參數對神經元進行電生理實驗。破膜形成全細胞記錄模式后，可在Multiclamp700B軟件界面上讀出I1,.k值，又值，在Clampex軟件中使用Membranetest可測最Cm、Rm、Ra值，確保18,.k<200pA,Vm<-50mV,Ra<20mfl,rm>SOMO。Rm最好為Ra的10倍以上，否則需要進行串聯電阻補償。圖3-8為應用Clampex記錄到的典型電流鉗記錄，圖3-9為應用Clampex記錄得到的典型電壓鉗記錄。
注意事項
1.取材過程中要保證神經元隨時處于氧飽和ACSF中或者處千有血流灌注的狀態下。
2.細胞內液及細胞外液的pH值和滲透壓值要符合生理狀態。
3.對細胞進行鉗制時，要選擇表面光滑的方位。
其他
1制備電極內液時要保證整個過程溫度在O℃左右，并且內液要用濾膜過濾3次以上，以保證內液中無雜質。
2.實驗過程中撕膜的程度決定了實驗的成敗，撕除背根神經節外膜后（硬脊膜），應注意其還有一層膜（蛛網膜及軟脊膜），應盡量將其去除，取出后神經節神經元有略蓬松感。撕膜時動作輕柔．注意勿損傷神經元。