細胞毒性T淋巴細胞的誘導及檢測

基 本 方 案 1 從 C TL 前體中誘導細胞毒性

注意：反應細胞應根據抗原的種類選擇是否需要進行體內致敏。

材 料

反應細胞來源：未致敏的或者體內致敏的小鼠脾臟細胞（見輔助方案 1 和 2

致敏培養基

刺激細胞來源：未修飾或半抗原修飾的小鼠脾臟細胞（見輔助方案 3)

R P M I -1 0 完全培養基

H B S S 溶 解 的 0.5m g / m l 絲裂霉素 C (避光保存）

刀豆蛋白 A (選用）：以 or 甲基-D -甘露糖苷中和后加上清至培養細胞中

IL-2 (選用）

帶有旋蓋的 15 ml —次性聚苯乙烯圓錐管（如 Falcon)

2 4 孔平底微量滴定板， 2m l 容積，帶 蓋 子（如 Costar)

注 ：實驗小鼠應避免影響實驗結果的感染，如 m y c o p l a s m a 和 免 疫 抑 制 性 病 毒（如

基本方案 2 絡釋放法分析 CTL 活性

材 料

輔 助 方 案 1 次要組織相容性抗原的小鼠體內應答

為在體內產生針對次要組織相容性抗原的應答，應 采 用 與 供 者 小 鼠 品 系 相 同 H -2并且同性的小鼠作為受者。為產生抗 H -Y 反 應（次要抗原的一個特例），采用雌性受者和同品系雄性小鼠的皮膚或細胞。

向受者小鼠移植皮膚或腹腔注射 IX IO7?5 X IO7 個 脾 臟 細 胞（在 0. 1?0. 5 ml 體積內；附 錄 2E ) ，與 單 元 1 .2 中的方法制備的弗氏完全佐劑形成乳濁液。用無血清培養基

稀釋細胞注射小鼠。在某些品系之間，可能需要在 10?Md 后再次注射 IO7 個脾臟細胞以產生強烈的體外再次應答。在通過適當途徑進行體內免疫后，按 誘 導 C T L (見基本方 案 1 ) 的方法制備脾臟單細胞懸液。對于再次應答，提供反應細胞的小鼠通常在最短1 周 最 長 1 年的時間內進行過體內免疫。

輔 助 方 案 2 病毒抗原體內免疫小鼠

將流感病毒尿囊儲存液用 1.0 ml P B S 稀 釋 至 300 血 凝 素 單 位（H A U )。按 附 錄 2E的方法進行腹腔注射。采用適當的途徑進行體內免疫后，收集細胞，按 誘 導 C T L (見基本 方 案 1 ) 的方法制備脾臟單細胞懸液。

抗 原 修 飾 刺 激 細 胞 和 靶 細 胞

在 51C r 釋放實驗中最好用活化細胞作為靶細胞，而正常脾臟細胞可用來刺激產生C T L (這樣可以避免耗時的活化步驟。）

輔助方案 3 T N P 修飾靶/刺激細胞

材 料

輔助方案 4 病毒感染靶/刺激細胞

材 料（其他材料見基本方案 2 )

不 考 慮 抗 原 特 異 性 的 總 C T L 活 性 評 價

下面的方案通過釆用有絲分裂原刺激 C T L 前體的方法繞過 M H C 限制性和 C T L 前體的抗原特異性。

備選方案 1 多克隆 C T L 活性的誘導

在 2 4 孔 微 滴 定 板 中 用 含 有 恥 2ug/ml C o n A 的 致 敏 培 養 基 培 養 反 應 脾 臟 細 胞