免疫球蛋白G(IgG)的純化

硫酸銨沉淀可純化小鼠抗體的所有亞類和其他種屬抗體，本方案也可用于純化任何種 屬 的 IgM、 IgG 和 IgA。

材 料

腹水 或 MAb 上 清（單 元 1.4)

VPBS

飽 和 硫 酸 銨（SAS)

硼 酸 鹽 緩 沖 液（可選）

聚丙燏酰胺葡聚糖凝膠 S-200 Superfine (Pharmacia Biotech)

含有 0. 0 2 % (m/VO NaN3 的 PBS (可選）

玻 璃 棉（Glasswool， Polysciences)

Sorvall 離心機， SS-34 型 轉 子（或類似轉子）

透 析 袋（無需按分子質量精確截斷），保存于蒸餾水中

26 mmX 900 mm 層 析 柱（Pharmacia Biotech)

la. 適用于腹水：為了清除腹水中的脂類物質，可用足量玻璃棉蓋住漏斗口，然后倒入腹水，再 用 PBS 充分沖洗玻璃棉，并戴好手套，輕輕擠壓玻璃棉，收集全部樣品(處理玻璃棉的時候請戴手套），將濾出液于 4℃或室溫下， 20 000g離心 30min，輕輕倒出上清并保存，棄去含膜和細胞碎片的沉淀。

lb. 適用于 MAb 上清：將 M Ab 上清于 4°C 或室溫下， 20 OOOg 離 心 30 min，輕輕倒出上清并保存。

2.邊攪拌邊慢慢向腹水或 MAb 上清中加入 SAS 至終濃度 4 5 % (V/V) ，靜 置 1?2 h 或4°C 靜置過夜，保證使所有蛋白質沉淀。

3.4°C 或室溫下， 20 OOOg 離 心 lh ，保留上清以檢測抗體活性。用最小體積的 PBS 或硼酸 鹽 緩 沖 液（10?20 ml) 溶解沉淀并轉移到透析袋中。于 4°C 在 至 少 2 0 倍體積的PBS 或硼酸緩沖液中透析 24?48 h，在透析過程中更換透析液 4?6 次 ，最后將蛋白質濃縮至≤ 5 ml (CPI附 錄 3 H) 。

4.準 備 26 mmX900 mm聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠S-200 Superfine 層析柱，將濃縮的蛋白質 溶 液 上 樣（CPI附 錄 31)。 用 PBS，或 含 0.02%NaN3 的 PBS或硼酸緩沖液洗脫蛋白質，收集1〇〇個組分（每個組分為1 % 柱體積，約 4. 5 ml)。 在 280nm波長檢測蛋白質組分。

5.用 非 還 原 型 和 還 原 型 1 0 % 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測A₂₈₀>0. 5 組分的蛋白質純度(單元12. 3)。在 非 還 原 型 凝 膠 上 IgG 的 條 帶 在 150kDa左 右 ，在 還 原 型 凝 膠 上 ，55kDa左右的條帶為IgG重鏈 ， 25kDa左右的條帶為IgG的輕鏈。 IgG2b的重鏈呈非對稱的糖基化，通常以二聚體形式存在。

6.用分光光度計測定IgG A₂₈₀濃 度（表 1.5.1)。將 含 純 IgG的洗脫液合并，用硼酸緩沖液或含0.02%NaN3 的 PBS調 整 IgG濃 度 至 0. 1?30 mg/ml，可 在 4°C 保存數年。長期保存可以將IgG置于一70°C保 存 ，不要將抗體在一20°C儲存超過一個月，要避免抗體的反復凍融。