實驗方法原理 藥物的體內代謝過程可分為I相反應（分解代謝）及II相反應（合成代謝）。I相反應包括氧化、還原和水解反應，主要由細胞色素P450（CYP450）酶催化。CYP450酶主要分布在肝臟，故又稱作肝藥酶。CYP450酶的誘導和抑制具有重要的臨床意義，可導致臨床上的藥物相互作用。苯巴比妥鈉為CYP450酶的誘導劑，而放線菌素D為CYP450酶的抑制劑。本實驗通過測定苯巴比妥鈉和放線菌素D對肝臟CYP450酶含量的影響，介紹了肝藥酶誘導劑及抑制劑的篩選方法之一。
CYP450酶含量的測定：CYP450為血紅素蛋白，其還原型與CO結合后，在波長450nm處出現吸收峰，故可通過測定溶液的吸光度值，反映溶液中CYP450酶的含量。
儀器、耗材 苯巴比妥鈉溶液放線菌素D溶液0.25mol L蔗糖溶液Tris-HCl緩沖液連二亞硫酸鈉生理鹽水分光光度計天平低溫離心機制冰機CO氣瓶玻璃勻漿器漏斗移液管冰盒
實驗步驟
1. 分組 先將小鼠逐一稱重，按照體重由小到大（或由大到小）排序。根據簡化隨機原則將小鼠分為3組（甲、乙、丙），每組3只。
2. 腹腔注射給藥 甲組為0.75%苯巴比妥鈉溶液，乙組為0.002%放線菌素D溶液，丙組為生理鹽水。每組小鼠均連續給藥3天。
3. 制備肝勻漿 小鼠處死，取出肝臟，注意勿破壞膽囊。稱重后，將肝組織置于玻璃勻漿器中，加入預冷后的0.25mol/L蔗糖液（0.5ml/100mg肝組織），冰浴下研磨至淡粉色勻漿。然后4攝氏度下10,000 g離心20 min后，留取上清液。
4. CYP450酶含量的測定 取離心后上清液1ml，加入預冷后的0.05mol/L Tris-HCl緩沖液9ml，充分混勻。冰浴下通CO氣，1~2氣泡/s，通氣2min。將通氣完畢的溶液分為兩半，分別置于兩個試管中：其一作為測定吸光度時的參照杯，另一加入連二亞硫酸鈉5mg，充分混勻，即為待測樣品杯。測定并記錄樣品杯在450nm和490nm波長下的吸光度值（表23-4）。
5. 計算CYP450酶含量
根據公式A = E·C·L，其中
A：吸光度
E：490nm到450nm波長的示差光譜消光系數，本實驗中E = 104L/cm·mmol
C：CYP450濃度
L：比色杯厚度（光路長度），本實驗中比色杯為1cm
因此，得到CYP450（nmol/g肝臟）= [(A450 - A490) / E·L]×50000
6. CYP450酶的誘導和抑制
（1） CYP P450升高百分率：
[(苯巴比妥組-生理鹽水對照組) /生理鹽水對照組]×100%
（2） CYP P450降低百分率：
[(生理鹽水對照組-放線菌素D組) /生理鹽水對照組]×100%
注意事項
1. 本實驗制備肝勻漿過程均需于冰上操作完成，所使用的溶液均需預先置于冰中預冷，以避免操作過程中造成的CYP450酶損失和破壞。
2. 取出肝臟過程中，注意不要破壞膽囊，以避免膽紅素對CYP450血紅素蛋白測定的影響和干擾。
3. CYP450（nmol/g肝臟）= [(A450 - A490) / E·L]×50000的計算公式，其中50000為本實驗制備肝勻漿過程中的稀釋倍數。
4. 測定肝勻漿中CYP450酶含量為簡單、粗略的測定方法。肝臟CYP450酶主要存在于肝細胞的滑面內質網上，故可采用超速離心法提取肝微粒體后，測定肝微粒體的CYP450含量。提取肝微粒體后亦可進一步與CYP450酶底物探藥共孵育，從而測定CYP450酶對底物藥物的代謝活性。提取肝微粒體方法簡述如下：將肝勻漿離心后得到的上清液，4°C下105, 000 g離心60 min，留取離心后的沉淀，加入肝微粒體重懸液（0.25 M蔗糖-0.1 M磷酸鉀緩沖液，1 mM EDTA，pH 7.4，1 ml/g肝臟）重懸，-80°C儲存待用。
5. 本實驗中CYP450酶含量的單位為nmol/g肝臟。若提取肝微粒體后，可通過測定肝微粒體的蛋白濃度（如Bradford法），求得單位蛋白濃度的CYP450酶含量