根分生細胞核蛋白質提取實驗

實驗材料 細胞核

試劑、試劑盒 Ficoll硫酸葡萄聚糖Tris-HClEDTA正辛醇

儀器、耗材 阿拉伯樹膠高速分散攪拌器

實驗步驟

3.1 植物材料

( 1 ) 洋蔥鱗莖，除去棕色干枯的外皮，用自來水清洗，將每一個正立放在加有大約 90 ml 過濾水的圓桶狀玻璃容器中，這樣只有底部浸沒在水中（見注釋 3)。水必須以 10~20 ml/min 的速率充氣。每隔 24 h 換一次水（見注釋 4) 。

( 2 ) 開始培養的 2~3 天之后，大部分的鱗莖會長出很多根；培養 3 天之后，可用于 95% 的鱗每個莖上長出多于 40 條的根，每條至少 2 cm。這些根可用于收集。

( 3 ) 用解剖刀或刀片，去除掉根冠，然后用鑷子夾取根尖前 3 mm；這部分就是根的分生組織（見注釋 5 和注釋 6) 。取大約 500 mg 的分生組織。

( 4 ) 將樣品放入有蓋培養皿中，培養皿直徑 4 cm，裝有 6 ml 提取介質，蛋白酶抑制劑 PMSF 需要在使用前加入。

( 5 ) 收集總量為 1 g 的根分生組織。

( 6 ) 培養皿必須被放置在冰塊上。

( 7 ) 注意：必須在通風櫥中進行實驗。

( 8 ) 使用真空泵除去樣品液的氣體 10 min，以促進介質滲透入樣品。

3.2 細胞核的提純

( 1 ) 根的分生組織放在提取介質（可以在 4°C 條件下放置 15 min 到一夜），并分別用直徑 100 μm，50 μm 和 30 μm 的網眼過濾。

( 2 ) 用抹刀收集留在尼龍布上的殘留樣品放入提取介質中，并將過濾的過程重復兩次。在勻漿過程中使用攪拌器旋轉棒攪拌試管中樣品，速度為 16000 r/min，攪拌 3 次，每次 5s，兩次之間停頓 5s。

( 3 ) 收集均一濾出液，并用在 800 g，4°C 離心 10 min 的方法漂洗濾出物。

( 4 ) 使沉淀在 1 ml 的提取介質中再次溶解。槍頭抽吸助溶，并離心 2 次以上。在這個過程結束后，沉淀含有較純的細胞核。

( 5 ) 將沉淀轉移進含有 1 ml NSB 的 1.5 ml 離心管中。在光學顯微鏡下鑒定細胞核餾分，并檢測它的豐度和純度。可用相差顯微鏡檢測，但是用簡單的染色劑，如甲基綠/派洛寧，甲苯胺藍，4,  6- 二脒-2- 苯基吲哚（DAPI ) 能夠幫助鑒別細胞核（見注釋 8 和注釋 9)。

3.3 用細胞核分餾法提取蛋白質

我們用 Penman 和其合作者 [ 10] 描述的方法設計這套實驗，并做相應改動 [14，15 ] 。最重要的改動是引入了提取大部分可溶性蛋白質的步驟。據報道可以溶解在低離子強度緩沖液中的細胞核蛋白質有一定的功能，因為其中富含在細胞核 RNA 代謝中活性較高的核糖核蛋白 [8，9，16，17 ] 。

總的來說，此方法包含一系列用溶解度為標準的蛋白質分餾方法。樣液依次增加嚴謹性和離子強度。提取方法步驟如下所述。

1. 膜和殘留細胞骨架的餾分

( 1 ) 第一步是被提純的細胞核在 NSB 中反應，緩沖液中富含去垢劑。

( 2 ) 在細胞核樣液中加入 ( V/V )  NP-40 和 0.5%  ( V/V） 脫氧膽酸鈉，并在 4°C 條件下在振蕩器中振蕩 10 min。然后在渦旋振蕩器中振蕩試管 2 次 ，每次 20s。

( 3 ) 在 1000 g、4°C 離心樣液 10 min，收集上清液，這即是第一份餾分（膜和殘留的細胞骨架，圖 8-1，泳道 M) 。

2. 可溶性餾分（S2)

在渦旋振蕩器上用 1 ml 低離子強度的緩沖液將沉淀再次溶解。在振蕩器中于 4°C 條件下振蕩 1h，然 后 1000 g、10 min，4°C 條件下離心，上清液為第二份餾分，被稱為 S2 提取物，含有核糖核蛋白（圖 8-1，S2) 。

3. 染色質餾分

( 1 ) 用 400 μl 含有 100 μg/ml 無 RNA 酶的 DNA 酶  I 和  0.5%  Triton  X-100  NBS 將沉淀在渦旋振蕩器中溶解。在室溫下振蕩 30 min，這會酶解 DNA。

( 2 ) 加入硫酸銨（400 μl ) 以提取被酶解的 DNA，并在室溫下反應 5 min  ( 見注釋 10)。如先前的步驟一樣，反應都是在旋轉的定軌振蕩器中完成。

( 3 ) 在 2000 g 離心 10 min，取上清液，餾分中含有和染色質有關的蛋白質（ 圖 8-1，Chr)。

在再測之前稀釋蛋白質，并根據稀釋的倍數算出最后的結果。