膜蛋白的分離、鑒定及其功能分析—GFC/IEC/SDS-PAGE 和 MALDI-TOF-MS 實驗試劑、試劑盒 分離緩沖液增溶緩沖液洗脫緩沖液Laemmli 樣品緩沖液膠段沖洗緩沖液酶解緩沖液肽抽提緩沖液
實驗步驟
3.1 膜的分離
因為在研磨材料時，要分離的膜組分以小囊泡形式與可溶的胞質蛋白質混合在一起，所以，最好在分離、鑒定膜蛋白前將這些胞質蛋白質去除掉。為了達到這個目的，我們需要用可穿透這些囊泡的達到臨界微胞濃度（CMC) 的去垢劑溶液來分離膜組分( 見注釋 1) ，使包覆親水性蛋白質慢慢地向外擴散。增溶緩沖液還含有一種離液鹽和一種二價金屬螯合劑用來解離松散結合在膜周邊的蛋白質。這里所介紹的分離植物質膜的實驗過程見圖 22-1。
( 1 ) 將 0.5~5 mg 的膜組分懸浮在分離緩沖液中（濃度為：0.2 mg/ml) ，4°C 攪拌混勻。
( 2 ) 測試時間可長達 4 h。
( 3 ) 經過處理后，將膜懸浮液于 4°C，100000 g 離心 1h。
( 4 ) 測定上清液和沉淀的蛋白質含量。
( 5 ) 在 SDS-PAGE 上分析膜外周蛋白質組分（上清液）和膜內鑲嵌蛋白質組分 ( 沉淀）的條帶。
3.2 蛋白質增溶
分離膜鑲嵌蛋白質首先需要使用去垢劑打破其天然脂環境 [ 8，9] 。這里介紹的方法中，我們使用中性或兩性離子去垢劑，因為這兩種去垢劑不會修飾由 IEC 分離出來的蛋白質的電荷。而且這兩種去垢劑作用溫和，能保持蛋白質的天然構象與活性。
( 1 ) 用 1 ml 增溶緩沖液室溫下增溶 0.5~5 mg 分離出來的膜組分。
( 2 ) 添加 1 ml DM 溶液于增溶緩沖液中，使 DM/蛋白質比例（m/m) 達到 3~7 ( 見注釋 2) 。
( 3 ) 渦旋混勻 2 min，室溫下低速攪拌，增溶處理 2 h。
( 4 ) 室溫下 190000 g 離心 1 h。
( 5 ) 定量分析上清液和沉淀中的蛋白質，獲得增溶產量。
( 6 ) 在 SDS-PAGE 上分析溶解蛋白質（上清液）和不溶解蛋白質（沉淀）的條帶。
經過這些步驟可獲得與初始 PM 蛋白質很相似的溶解蛋白質的 SDS-PAGE 圖譜 ( 圖 22-2)，約有 85% 的初始蛋白質可經上述實驗過程溶解出來。
3.3 色譜層析
1. IEC/SDS-PAGE 分離
使用 Mono Q HR 5/5 層析柱（Pharmacia/Amersham Biosciences 公司）進行陰離子交換色譜層析（A EC，見注釋 3) ，在整個層析過程中，用 280 nm 吸收監測蛋白質洗脫，并設定組分收集容積為 0.3 ml。樣品和洗脫緩沖液中的去垢劑容易在管道系統中形成泡泡，因此，建議小心超聲處理（30 min ) 緩沖液和調整洗脫速度（0.5~1 ml/min) 。
( 1 ) 室溫下，用 15 ml 洗脫緩沖液平衡層析柱。
( 2 ) 將新增溶出來的蛋白質（0.5~2 mg 蛋白質，2 ml 溶液）上樣到層析柱上，當收集組分時，用 5 ml 洗脫緩沖液沖洗柱子。
( 3 ) 用 10~15 ml 線性鹽梯度（在洗脫緩沖液中含 0~1 mol/L NaCl 鹽濃度）洗脫蛋白質。
( 4 ) 用 5 ml 含有 1 mol/L NaCl 的洗脫緩沖液沖洗柱子，將柱子里的殘留樣品洗出。
( 5 ) 在收集的組分中加入冷丙酮 [ -20°C，80% ( V/V) ] ，于 -20°C 下過夜，用以沉淀蛋白質。
( 6 ) 用微量離心機 4°C 條件下 17000 g 離心 30 min。
( 7 ) 在上述用丙酮沉淀的蛋白質樣品中加入 50 μl 的 Laemmli 樣品緩沖液，渦旋振蕩，并超聲波振蕩處理（超聲波水浴中處理 15 min) ，重懸沉淀的蛋白質。
( 8 ) 用 SDS-PAGE 分離蛋白質條帶。
具代表性的 IEC/SDS-PAGE 分離方法（從 0.5 mg 酵母質膜增溶出來的蛋白質幵始）見圖 22-3A。我們可以看到 3~6 個連續收集的組分中都含有同一條帶，用 MALDI-TOF/MS 可以從 70% 的電泳條帶中鑒定出一個蛋白質，從 5%~25% 的條帶中鑒定 2 個或 3 個蛋白質（圖 22-3B) 。比較連續排列的不同處理的同梯度洗脫下來的陰離子交換層析（AEC ) 組分的 SDS-PAGE 泳道來進行數據分析。