技術推薦|ChIP的新玩法

　　如果研究者們想知道蛋白在做什么，他們通常會采取直接的方式：免疫共沉淀能知道蛋白A和蛋白B有沒有在一起，ChIP能確定蛋白A是否與核酸序列B結合。

　　染色質免疫共沉淀ChIP可以鑒定與指定蛋白結合的DNA序列，其基礎理念能追溯到幾十年前。如今ChIP已經成為了表觀基因組學的一個基本工具，與新一代測序聯合使用可以實現基因組調控區域的定位和圖譜分析。

　　過去人們傾向于將大部分精力放在蛋白編碼區域，斯坦福大學醫學院的Michael Snyder教授說。“很明顯調控區域也是非常重要的。ChIP差不多是找出這些調控區域的最佳途徑。”

　　ChIP實驗主要是通過交聯把蛋白質-DNA互作固定下來，破碎細胞并釋放其中的染色質。隨后將DNA打碎成小片段，用針對靶蛋白的抗體捕獲我們想要的DNA。最后去除交聯復原DNA，再通過PCR、DNA芯片或測序進行檢測。

　　ChIP的基礎理念多年來并沒有太大的改變，但開發者們一直在不斷進行著優化。

　　處理低量細胞

　　傳統ChIP往往需要使用大量的細胞，一百萬甚至更多。對于成天與臨床樣本打交道的研究者而言，FACS分選細胞和FFPE細胞很難達到這樣的要求。

　　在這種情況下，Active Motif公司的ChIP-IT? High Sensitivity kit就是一個不錯的選擇。從產品資料上看，這種試劑盒適合處理低量細胞（1000個細胞）或低豐度蛋白（50,000個細胞），尤其是一些稀有轉錄因子。“這是目前我們最暢銷的產品之一，”該公司的產品經理Kyle Hondorp說。

　　如果你想要對這樣獲得的DNA進行測序，可以試一試Kapa Biosystems公司的KAPA Hyper Prep Kit。這種試劑盒能用ChIP生成的低量DNA（100 pg）構建測序文庫，Kapa公司的支持和應用經理Adriana Geldart介紹道。

　　最近Active Motif公司還發布了低量細胞的ChIP-Seq技術服務，你只需要提供一萬個細胞，就能將相關工作丟給他們去做。

　　固態ChIP

　　傳統ChIP通過偶聯蛋白A或蛋白G的瓊脂糖或磁性微珠，來沉淀抗體-染色質復合物。Chromatrap公司將這個過程改造成一種基于過濾器的新方法。

　　Chromatrap分析用蛋白A或蛋白G包被的多孔過濾器取代微珠，省去了許多ChIP相關的傳統液體處理步驟。“它基本上是一種固態ChIP分析，”Chromatrap公司的Stephen Knight指出。

　　這種方式可以顯著減少洗脫和移液步驟中的樣本損失，“我們加樣之后，樣品就留在基質中，”產品開發經理Amy Beynon說，“洗脫只需30秒，而微珠需要五分鐘。”當然，這也大大縮短了ChIP所需的時間。

　　Chromatrap分析產品具有多種不同的規格，比如離心柱、96孔板、為下游qPCR或測序優化的試劑盒。另外，你還可以選擇超聲或是酶消化。“我們目前有36種試劑盒，”Knight說，這一數字正在持續增加，2016年第一季度將達到50種。

　　該公司逐步在一月份發布native Chromatrap試劑盒（即非交聯試劑盒）。之后不久，他們還會發布一個針對FFPE樣本的試劑盒。

　　反向ChIP

　　ChIP可以用來鑒定與指定蛋白相互作用的基因組區域。如果我們想要知道某個基因組片段的相關蛋白該怎么辦呢？2013年大阪大學的Hodaka Fujii發表了一個這樣的方法，并將其命名為enChIP（engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation）。

　　enChIP使用催化失活的CRISPR/Cas9系統和自定義的引導RNA，來特異性捕獲指定基因組片段上的大分子（包括蛋白、RNA或DNA）。enChIP抗體靶標的不是特定蛋白，而是Cas9附帶的多肽標簽。

　　研究者們可以通過這種方式，鑒定與目的DNA相關的任何蛋白、RNA或其他DNA，Hondorp介紹道。（Active Motif正在將這種方法商業化，并計劃在2016年上半年推出。）

　　“傳統ChIP是靶標特定蛋白，鑒定它所在的基因組位點，” Hondorp解釋道。“enChIP是反向的，靶標基因組區域然后鑒定誰結合在那里。”這種試劑盒可以檢測染色質成環（與Hi-C類似），或者在CRISPR/Cas9研究中分析引導RNA的脫靶情況。

　　ChIP抗體

　　市面上的ChIP試劑盒種類繁多，但你可能并不真的需要它們，Novus Biologicals公司的產品經理Paul Spear說。ChIP經驗豐富的實驗室往往使用自制試劑，比如Snyder教授的實驗室。該實驗室在承擔ENCODE項目的時候，使用了數百種ChIP抗體。“這種情況真的沒必要購買試劑盒，”Snyder說。

　　從本質上看，ChIP實驗中只有一個試劑是至關重要的，“最重要的還是抗體怎么樣，” Snyder指出。

　　沒有哪一種抗體適合所有的實驗，因此供應商一般會標明抗體是否做過ChIP驗證。Abcam公司提供有大約六百種ChIP驗證抗體，Novus Biologicals公司擁有大約四百種，而Chromatrap公司最近也發布了自己的第一批抗體（九種）。

　　雖然許多公司都在不遺余力地測試自己的抗體，但自己驗證一下抗體是比較明智的，Snyder說。2012年他和同事列出了ENCODE 和modENCODE項目的抗體使用指南，詳細說明了轉錄因子和組蛋白修飾抗體的驗證方法。在他們測試的抗體中，“只有四分之一或五分之一”適合ChIP。專家給出的建議是，新抗體買來之后應該用供應商推薦的步驟和對照進行測試。