一、提取抗原蛋白
將提取RNA途中留存的樣品，加入150μl100%酒精充分混勻，靜置 5min(RT),2000×g,4℃離心5min,吸取上清至新管中,加入750μl異丙醇,混勻,靜置10min(RT),12000×g,4℃離心 10min,棄上清,加入1ml0.3mol/L鹽酸胍/95%酒精重懸沉淀,用加樣器打散沉淀,混旋20~30秒,靜置 20min(RT),7500×g,4℃離心5min,棄上清,重新加入1ml0.3mol/L鹽酸胍/95%酒精兩次,重懸沉淀,離心后棄上清,加入 100%無水乙醇1ml,混旋1min,靜置20min(RT),7500×g,4℃離心5min,棄上清,真空干燥5min,50μl1%SDS溶解沉淀，用50℃熱水助溶，直至全部溶解。10000×g,離心10min,去除沉渣。
二、蛋白定量
1. 取PBS、各樣品10ul，加DW990ul
2.取DW勻漿緩沖液、樣品稀釋液、系列牛血清白蛋白標準濃度0.5ml。
3.向各管加入2.5mlD試劑（A50ml＋B0.5ml＋C0.5mlA－2%Na2CO3、 0.1NNaOH，B－0.5%CuSO4，C－1%酒石酸鈉）混勻，靜置10分鐘。
4.迅速加入酚試劑0.25ml，混勻37℃水浴30分鐘。
5.721分光光度計650nm，比色，S0標準管調零。
6.最后稀釋為 4ug/ul，加載樣緩沖液后，終濃度為2ug/ul，上樣量為30～80ug/泳道。
三、電泳
1.makegel．
11%分離膠 12ml 兩塊膠 | 4%積層膠6ml兩塊膠 |
DW4.36 ml | DW堵漏3.66ml |
3M Tris3.0 ml | 0.5M Tris1.5 ml |
30%Arc4.4 ml | 30%Arc0.5 ml0.78 ml |
10% SDS0.24 ml | 10%SDS60 ul |
10%APS0.12 ml | 10%APS20ul30 ul |
TEMED10ul | TEMED5ul6ul |
2.上樣前樣品處理：
樣品100℃、3分鐘、冷卻，900×g、離心30S。
3.通電電：積層膠電泳電壓50V左右，分離膠電泳電壓90～110V。
4.考馬斯亮藍染色：1小時，1號脫色1小時，2號脫色2小時。
四、電轉印
1. 將濾紙NcM切成與凝膠尺寸大小，置于DM中浸透5分鐘，電轉液平衡15分鐘。
2.轉移：用二張大濾紙貼于兩張多孔墊料，將NcM、膠夾于中間，在NcM與大濾紙之間墊小濾紙。NcM朝正極，20V恒壓轉移12小時。取下NcM雜交，凝膠染色看效果。
五、雜交
1. 取下NcM，做好標記，dH2O沖洗，室溫濾紙干或放入膜固定液15分鐘。
2.NcM用PBS沖洗二遍，呈 5～6%non－fatmilk的pH7.2的PBS中封閉，室溫６－８小時或室溫1－2小時，4℃，過夜。
3.將封閉的膜用ＰＢＳ沖洗一遍，洗15分鐘×1，5分鐘×2。
4.加入一抗1:1000－1200，室溫，反應1小時
5.PBS洗15分鐘×1，15分鐘×4。
6. 加入二抗1:5000，室溫，反應1小時。
7.PBS洗15分鐘×1，5分鐘×4。
六、化學發光試劑檢測
1. 混合等體積Bottle1&2與NcM共孵育1分鐘。
2.放射自顯影：曝光3分鐘至10分鐘。
3.顯影后清水漂洗，再定影。
七、所用試劑
1、勻漿緩沖液4×1L：
NaH2PO4（·H2O） | 12.48g |
Na2PO4·12H2O | 114.6g |
NaCl | 3.6g |
dw 800ml, adjustpHto7.0,adjustVolto1 L |
（1）用時稀釋4倍。
（2）40ml PBS＋PMSF 40 ul＋1.10 phenautehroline 80 ul＋Iodo 80ul＋pepstalmA 80ul
2. 系列牛 血清蛋白濃度稀釋法：
取500ug / ml BSA按下法配制：
500ug / ml BSA | NS | 蛋白濃度ug / ml | |
S1 | 50 ul | 1.95 ml | 12.5 |
S2 | 100 ul | 1.90 ml | 25 |
S3 | 200 ul | 1.80 ml | 50 |
S4 | 400 ul | 1.60 ml | 100 |
S5 | 800 ul | 1.20 ml | 200 |
3. 30%Acrylamide
29.2g單丙、0.8g雙丙溶解于60 mlDDW，調Vol到100 ml
4. 3M Tris－Hcl buffer pH 8.9 100ml.
稱Tris 36.3g溶于水到100 ml，調pH到8.9
5. 0.5 M Tris－Hcl buffer pH 6.7 100ml
稱Tris5.98g溶解后，調pH到6.7，調體積到100ml
6. Samples buffer 10ml
10%SDS | 2 ml | |
甘油 | 1 ml | |
0.5MTris | 1.6 ml | 用前按9 : 0.5 : 加0.1溴酚蘭、0.5% DTT貯備液。 |
DDW | 5.2 ml |
7.電轉液1LpH 8.2－8.3
Glycine | 14.42 g |
Trisbase | 3.02 g |
dH2O | 800 ml |
Methanol | 200 ml |
10% SDS | 2 ml |
8.pH 7.2PBS2 L
NaCl | 18.0g |
KCl | 0.44g |
Na2HPO4 | 2.84g（7.16g） |
NaH2PO4 | 0.432g（0.562g） |
加DW到2 L |
9.10×電極緩沖液400 mlpH 8.4
Tris base | 12.2 g |
甘氨酸 | 57.76 g |
加DW 400 ml, 調pH8.4，用前加SDS0.1% |
10.脫色液1號
甲醇 | 250 ml |
冰醋酸 | 50 ml |
＋DW到500 ml |
11.脫色液2號
甲醇 | 100 ml |
冰醋酸 | 75 ml |
＋DW到1000 ml |