RT-PCR實驗有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：
1.做RT前必需測RNA濃度，逆轉錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不會出太大問題。
3. PCR，按常規。但如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。
1）RT和PCR時的引物設計是不是一定要先知道目的基因的序列？必須
在RT時，引物設計有3種方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特異的下游引物。如果用a和b方法，是擴增的所有的cDNA（理論上），還要用此產物做PCR 的模板繼續擴增。
如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？http://www.ncbi.nlm.nih.gov
問題：
在做RT-PCR遇到一怪現象，即對同一動物不同組織擴增同一段基因，結果從一種組織中可以擴出我的目的基因，條帶非常的好，而另一組織在同樣的條件下卻得到許多非特異性的條帶，嘗試其他條件同樣無法得到滿意的結果，百思不得其解！（注：已肯定該基因在兩種組織中都表達，且內參照在兩種組織都可擴增出來）
從這兩種組織中提取的RNA的量是不一樣的，我測過吸光度，差異還很大，會不會和這有關呢？ 請高手指教！
解答：
1.RT- PCR有兩種做法：
條件具備的話可用kit進行一步法進行；若條件不太好的話可分兩步進行逆轉錄再PCR。但后來發現兩步法的結果更加理想，條帶特異性強且無拖尾現象，我推測是體系更加單一比較利于PCR的進行，當然也可能是我買的kit不太好。（promega）。
2.RT-PCR 應具備的條件
高質量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好產物短點）；若涉及粗略定量的話還應考慮RNA的濃度或是cDNA 的濃度（如果由內標分子更好，但我發現其實很不容易將RNA的濃度以及內標分子的表達量調整的完全一樣）；體系的均一性等。
3.RACE
我做過RACE（3’RACE是寶生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但現在再進行另一個同源基因的3‘RACE時卻怎么也P不出來，這兩個基因是由同一對引物擴增出來的，其中一個已經獲得了全序列（RACE的方法），而另一個基因的3’UTR卻增么也擴不出來，我推測是不是該基因的3‘UTR太長的緣故，我都快綠了，有無
RT-PCR的常用內標b－actin 和GAPDH的使用有選擇性嗎？比如不同的細胞，不同的刺激。
有關內參：
RT-PCR內參照可以在一個管子里做（那樣也是圖好看一些），最好分開兩管，把除了引物之外的mixture統一配，拍照后，算目的基因和內參的比值，這就是基因表達的相對濃度。
問：我曾經作過同一管的PCR，內有actin 和目的基因引物。雖然可見到兩條均一條帶但圖片質量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。請教mxbdna2003 ，你是如何處理同一管的PCR的各成分的濃度？
答： it should determined the amount of RNA. but it not for the
quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the
template<(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if
he don not know the preocedure much. but the amount just using "accurate
piptte" is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of
housekeeping gene everytime.
在同一管中做RT，其實沒有什么問題，不需要taq魅加量，taq酶本來就是過量的^-^，（平時做pcr的時候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八兩就可以了，我想這肯定再很多貼子里應該都談到了。Mg就跟不能變了，一變整個體系就變了。能看到均一條帶就很好了。
關鍵是摸，十八摸（太少，只爭朝夕，開個玩笑）雖然用不著，但是摸上3、5摸總是必要的，首先遙分開摸，然后再一起摸，直到摸的好了，還要考慮比較的不同的模板中的量，所以我們不建議再同一管中進行，因為還有互相競爭抑制的問題，即使不同基因之間。
有關內參的建議：
一定要做內參的，每一次，我想。不作內參的結果是不可信的
電泳可以不一起跑，沒有關系，計算的是相對表達程度，著我在好幾封帖子里都談了，再說一邊我得觀點，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對表達量，不是絕對表達量，除非你能準確知道來自多少細胞，但是細胞還有死的呢。2、以電泳為基礎的半定量RT-PCR本身是不可信的，作為實驗的粗篩是可以的，但不能作為最終結果的，3、半定量RT-PCR
應該再兩管中進行，除非內參基因和目的基因表達相同，長度差不多，GC含量相似，或者實在窮的要省PCR管和taq。