小鼠骨髓細胞微核試驗

原理>

微核試驗是用于染色體損傷和干擾細胞有絲分裂的化學毒物的快速檢測方法。微核是指存在于細胞中主核之外的一種顆粒，大小相當于細胞直徑的1/20～1/5，呈圓形或杏仁狀，其染色與細胞核一致，在間期細胞中可以出現一個或多個。一般認為微核是細胞內染色體斷裂或紡錘絲受影響而在細胞有絲分裂后期滯留在細胞核外的遺傳物質。所以，微核試驗能檢測化學毒物或物理因素誘導產生的染色體完整性改變和染色體分離改變這兩種遺傳學終點。

微核可以出現在多種細胞中，但在有核細胞中較難與正常核的分葉及核突出物相區別。由于紅細胞在成熟之前最后一次分離后數小時可將主核排出，而仍保留微核于PCE細胞中，因此通常計數PCE細胞中的微核。

※<(三)器材與試劑>

1 器材 手術刀、手術剪、無齒鑷、小型彎止血鉗、干凈紗布、帶橡皮頭吸管、臺式離心機、刻度離心管、晾片架、電吹風機、玻璃蠟筆、玻璃染色缸、2ml注射器及針頭、載玻片及推片、定時鐘、帶油鏡頭顯微鏡、細胞計數器。

2 試劑 甲醇(分析純)、甘油(分析純)、小牛血清、生理鹽水、Giemsa儲備液(取Giemsa染料1g，甘油66ml，甲醇60ml。先將染料置于研缽內，加入少量甘油混合研細，再分次傾人剩余的甘油繼續研磨，然后轉移至燒杯內，蓋上玻璃表面皿，置60oC水浴2h，取出待冷卻后加入甲醇，混合靜置2周后，過濾于棕色瓶內，存放陰涼處。該儲備液存放的時間越長，染色效果越好。臨用時用pH6.8的磷酸鹽緩沖液配制為10％的應用液)、pH6.8的磷酸鹽緩沖液。

(1)I/15mol/L磷酸二氫鉀(KH2P04)溶液：稱取分析純KH2P04 9.06g，用蒸餾水溶解并定容至1000ml。

(2)1/15mol/L磷酸氫二鈉(Na2HPO4)溶液：稱取分析純Na2HPO4，9.45g(或Na2HPO4·2H20 11.87g；Na2HPO4·7H20 17.87g；Na2HPO4·12H20 23.88g)用蒸餾水溶解并定容至1000ml。

(3)pH6.8的磷酸鹽緩沖液：取l/15mol/L的磷酸二氫鉀溶液50.40 ml和1/15mol／L的磷酸氫二鈉溶液49.60ml，兩者混合均勻即成。

3．陽性對照物 環磷酰胺或絲裂霉素C。

※<(四)操作步驟>

1．試驗動物及處理

(1)動物選擇：一般常用的試驗動物為大、小鼠。以小鼠使用最為廣泛，要求體重18～20g，7~12周齡。每組小鼠數量10只，雌雄各半。

(2)染毒途徑：根據研究目的或受試化學毒物性質的不同，可分別選用經口、經皮、經呼吸道及注射等染毒途徑。但原則上應盡可能采用與人體接觸化學毒物相同的途徑。

(3)染毒次數及取樣時間：研究證實化學毒物需在靶器官內蓄積至一定的濃度才具有致突變作用。不同化學毒物誘發微核出現的高峰時間也不盡相同。波動范圍可以達到24～72h。這就要求在接觸化學毒物后設立不同的采樣時間點。考慮到以上兩方面的原因，建議采用多次染毒的方法。其中以4次染毒比較方便合理。即每天染毒一次，連續4天，第5天取樣。這樣，取樣一次就能覆蓋24～72h高峰，如果高峰延遲到96h也不會漏掉。

(4)劑量選擇：受試化學毒物的最大劑量除受溶解度大小所限外，應達到最大耐受量。葉般情況下，應設3～5個或更多劑量組，劑量覆蓋的范圍要達到3個數量級以上。同時還應設立陽性對照組和陰性對照組。陽性對照組可用環磷酰胺(50~100mg／kg)或絲裂霉素C(10mg／kg)腹腔注射1次或2次。陰性對照組使用等體積的溶劑。

2．骨髓液的制備和涂片 試驗動物最后一次染毒后，按確定的時間用頸椎脫臼或麻醉，的方法將其處死，四肢固定于解剖板，將腹中線被毛浸濕，剖開胸腹部，取下胸骨，擦凈血污，剔去肌肉，剪去骨骺，用小型彎止血鉗將骨髓擠于有一滴小牛血清的清潔載玻片上，混合均勻后推片。也可在動物處死后，迅速用手術剪將其兩腿股骨取下，剔去肌肉，用生理鹽水洗去血污和碎肉，剪去兩端的骨骺，用帶針頭的2ml注射器吸取小牛血清，插人骨髓腔內，將骨髓沖人離心管，然后用吸管吹打骨髓團塊使其均勻，以1000r／min離心10min，棄去多余的上清液，留下約0.5ml與沉淀物混勻后，用滴管吸取并滴一滴在清潔的載玻片上，推片。陽性及陰性對照組按上述方法同時進行處理。

3．固定 將推好晾干的骨髓片放人染色缸中，用甲醇溶液固定15min，取出晾干。不能及時染色的涂片也應固定后保存。

4．染色 將固定晾干后的涂片，用新鮮配制．的Giemsa應用液(Giemsa儲備液l份加pH6.8的磷酸鹽緩沖液9份)染色10~15min，然后沖洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。

5．觀察計數 先在低倍鏡下進行觀察，選擇分布均勻，染色較好的區域，再在油鏡下觀察計數，PCE細胞呈灰藍色，正染紅細胞(NCE)呈橘黃色。細胞中含有的微核多數呈圓形，邊緣光滑整齊，嗜色性與核質一致，呈紫紅色或藍紫色。一個細胞內可出現一個或多個微核。計數1000個PCE中含微核的PCE數，并且計數200個細胞中PCE與NCE的比值。
※<(五)結果分析與評價>

本試驗中只計數PCE中的微核，微核率以千分率表示。每只動物為一觀察單位。每組的雌、雄動物分別計算微核PCE的均值。雌、雄動物之間無明顯的性別差異時可合并計算結果，否則應分別進行計算；正常的PCE／NCE比值約為1(正常范圍為0.6～1.2)。如比值<0.1，則表示PCE形成受到嚴重抑制，受試化學毒物的劑量過大，試驗結果不可靠。陰性對照組和陽性對照組的微核發生率，應與試驗所用動物種屬及品系的文獻報道結果或者是與研究的歷史數據相一致。
微核試驗所獲數據資料的頻數分布尚無定論，多種統計學方法(如泊松分布、二項分布、X2檢驗等)均有人用于試驗結果的統計分析。該試驗的關鍵步驟是制作良好的骨髓涂片及優質的染色。