二、噬菌體載體
作為細菌寄生物的噬菌體，大多數具有編碼多種蛋白質的基因，能利用宿主細胞的蛋白質合成體系，進行生長和增殖。構建的噬菌體載體，以λ噬菌體、M13和粘粒最為常用。
㈠ λ噬菌體載體
野生型λDNA是一種基因組為4.8 kb的線性雙鏈DNA，全部序列已知，共編碼50多個基因。其中約一半基因參與了噬菌體的生命周期活動，稱為必需基因；另一部分基因，當被外源基因取代后，并不影響噬菌體的生命功能。另外，在分子兩端各有12個堿基的互補單鏈，是天然的粘性末端，稱cos位點。
野生型的λ噬菌體是一種中等大小的溫和噬菌體，即既能進入溶菌性生命周期又能進入溶源性生命周期。λ噬菌體感染細菌后，λDNA通過粘性末端而環化。既可溶菌性生長（裂解），即λDNA在宿主中多次復制并合成大量基因產物，裝配成噬菌體顆粒，最后裂解宿主菌；又可以溶源性生長，即λDNA整合到宿主染色體基因組DNA中，與之一起復制并遺傳給子代，但宿主細胞不被裂解。裂解途徑和溶源途徑的選擇取決于宿主與噬菌體之間的許多因素的相互作用，以及噬菌體基因組的精確調控。
λ噬菌體具有二個重要特征，使之成為一類重要的、很有價值的基因克隆載體。①除必需基因外的功能相關（溶源生長和重組）基因成簇排列在一起位于中間部分，約占全基因組的30%，不是溶菌生長所必需的。因此，該區可缺失或作外源DNA的插入區。②噬菌體顆粒成熟的包裝過程（外殼蛋白包裝DNA），只要重組DNA不小于野生型λDNA全長75%和大于105%，均可被包裝成具有噬菌體活性的成熟顆粒。因此大約可插入長達15kb的外源DNA。
當外源DNA片段克隆到插入型載體上，噬菌體便喪失某些生物學功能，即插入失活效應。又可分為免疫功能失活的和β-半乳糖苷酶失活的兩種亞型。①免疫功能失活的插入型載體。插入位點位于基因組中的免疫編碼區，外源DNA片段插入后，就會使載體合成阻遏蛋白的能力被破壞，導致不能進入溶源生長周期。因此凡有外源DNA插入的λ重組體都會形成清晰的噬菌斑，而未有外源DNA插入空載體則形成混濁的噬菌斑。這種形態上的差別，為分離陽性重組體提供了方便的選擇標記。②大腸桿菌β-半乳糖苷酶失活型載體。插入位點位于基因組中的β-半乳糖苷酶（LaZ）編碼區，因此可通過藍白斑實驗篩選。對于替換型載體，當外源DNA插入時，一對克隆位點間的基因組DNA被替換（取代），從而喪失某些生物學功能，造成重組體與空載體形成噬菌斑形態（清晰和混濁）或顏色（藍白斑實驗）差別，這種差別即可作為篩選標記。
這兩類λ噬菌體載體具有不同的特點，在基因克隆中的用途也不盡相同。插入型載體只能容納較小分子的外源DNA片段（一般在10kb以內），廣泛用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替換型載體則可容納較大分子的外源DNA片段，可用于高等生物染色體DNA片段克隆。但不管是哪種類型，體外重組體DNA分子，其大小應不小于野生型λDNA的75%和不大于105%，否則不能包裝成有活性的噬菌體顆粒。
λ噬菌體載體結構舉例說明。
λgt10（插入型）和Charon 40（替換型）結構示意
㈡ 粘粒載體
粘粒又稱柯斯質粒（cosmid），“cosmid”一詞是“cos site-arrying plasmid”的縮寫，其原意是指帶有粘性末端位點（cos）的質粒。粘粒載體由質粒和λ噬菌體的cos粘性末端構建成而成。其質粒DNA部分是一個完整的復制子，包括復制起始位點、一個或多個酶切位點和抗菌素抗藥性基因（Ampr和/或Tetr），因此粘粒也能象質粒一樣用標準的轉化方法導入大腸桿菌和進行篩選；其λ噬菌體片段帶有一個將DNA包裝到λ噬菌體顆粒中所需的序列，除了cos粘性末端之外，在其兩端還具有與噬菌體包裝有關的短序列，故又能被包裝成具有感染性的噬菌體顆粒。很明顯粘粒兼具了質粒和噬菌體二者的優點。
目前已經發展出了許多不同類型的粘粒載體，例如c2XB、pHC79、pTL5、pJC74、pJC720、pJB6和pJB8等。粘粒載體大體上有以下四方面的特點：
1．具有λ噬菌體的特征 粘粒載體在體外克隆了適當長度的外源DNA并被包裝成噬菌體顆粒之后，可以似λ噬菌體一樣高效地轉導對λ噬菌體敏感的大腸桿菌寄主細胞。進入寄主細胞的粘粒DNA分子，便按照λ噬菌體DNA同樣的方式環化并進入溶源周期。但由于不能夠通過溶菌周期，無法形成子代噬菌體顆粒。
2．具有質粒載體特征 粘粒載體有質粒復制子，因此在寄主細胞內亦能象質粒DNA一樣進行復制，并且在氯霉素作用下也能獲得進一步的擴增。另外，粘粒載體還通常具有抗菌素抗性基因，可作為重組體分子的篩選標記。
3．具有高容量的克隆能力 粘粒載體僅含一個復制起始位點、一二個選擇標記和cos位點三個部分，其本身大小僅為5～7kb。因此插入外源DNA片段可大到45kb。這一裝載容量比λ噬菌體載體和質粒載體要大得多。
4．具有與同源序列的質粒進行重組的能力 粘粒載體能與共存于同一寄主細胞中的帶有共同序列的質粒進行重組，形成共合體。當一個粘粒載體與帶有不同抗藥性標記的質粒轉化同一寄主細胞時，便可篩選到具有相容性復制起點的共合體分子。
粘粒載體pJB8
㈢ 單鏈絲狀噬菌體載體
大腸桿菌的絲狀噬菌體包括M13噬菌體、f1噬菌體和fd噬菌體，其基因組都是一個長度6.4kb且彼此同源性很高的單鏈閉環DNA分子。下面以M13為例簡要介紹單鏈絲狀噬菌體載體的特點。
M13噬菌體顆粒外形成絲狀，是一種既不溶源也不裂解宿主細胞的噬菌體。其感染型是單鏈DNA（＋鏈），感染宿主（通常是大腸桿菌）后，借助宿主的酶系統，先將單鏈DNA復制為雙鏈DNA（復制型），復制型在菌體內繼續增殖，可達200拷貝。感染的細胞能夠繼續生長和分裂，每個細胞每個世代可釋放出1 000個左右的子代噬菌體顆粒。因此培養基中可收集到大量的M13噬菌體顆粒。
通過對M13噬菌體進行改造，已成功地發展出了M13mp噬菌體載體系列，例如M13mp8、M13mp9和M13mp10、M13mp11等。M13mp系列都是從同一個重組體（M13mp1）改造而來的，在M13主要基因間隔區插入了帶有大腸桿菌LacZ的調控序列和N端頭146個氨基酸的編碼信息，且在其中插入了多克隆位點序列。因此重組體也可用IPTG-X-gal藍白斑實驗進行篩選；M13mp系列大多是成對的，且有pUC質粒系列的多克隆位點與之對應。