DNA重組（DNArecombination）技術：外源基因的蛋白表達4

（3）CHO細胞穩定表達系統：動物細胞瞬時表達系統中外源基因沒有穩定地整合到宿主細胞染色體中，一染色體外DNA的形式存在。因而只能瞬時表達。要使外源基因在宿主細胞中高效、穩定地表達，必須建立一個穩定表達系統，包括適宜的表達載體、有效的基因轉染、標記基因和目標基因的選擇與共擴增、受體適當的受體細胞和培養條件。現以pMT2為載體，二氫葉酸還原酶（DHFR）未標記基因， CHO細胞為受體細胞，介紹哺乳動物細胞穩定表達系統。
pMT2在哺乳動物細胞穩定表達系統中和瞬時表達系統中有所不同，區別在此表達載體中含有鼠的DHFR基因序列，作為選擇標記基因，并在動物細胞內可進行擴增。pMT2表達載體既可在瞬時表達系統中起作用，又可在穩定表達系統中穩定表達外源基因。

選擇性標記基因的作用就是為帶有外源基因的哺乳動物細胞提供選擇標記。作為選擇性標記基因必須和目的基因一起轉染細胞，并在細胞中進行擴增，然后作為標記獲得含有目的基因的細胞。DHFR時目前應用得比較廣泛的選擇性標記基因。DHFR的作用指催化二氫葉酸還原成四氫葉酸。當葉酸的類似物氨基喋呤和氨甲喋呤（methotrexate,MTX）存在時，可與葉酸競爭結合DHFR并抑制DHFR的活性，使細胞死亡。當細胞中DHFR基因大量擴增，并有高表達時，MTX不足以競爭結合全部的DHFR，使細胞在含有MTX的培養基中可存活。利用這一特點，和外源基因共同擴增的DHFR基因可利用它對MTX的抗性，篩選出含目的基因的細胞。
一般選用DHFR基因缺陷的CHO細胞，便于篩選目的基因。CHO細胞適用于多種蛋白質的分泌表達和胞內表達；有對培養基的適應性強的特點；可進行大量的培養，大規模生產。

外源基因的轉染方法可選用磷酸鈣共沉淀方法、聚乙二醇介導的細胞融合法以及電穿孔導入法等。要想得到長久穩定表達的細胞系，必須對轉入的目的基因及可擴增的選擇性標記基因通過增加選擇物的濃度（DHFR基因通過增加MTX濃度），使外源基因進行擴增，并穩定地整合入宿主細胞的染色體上。當細胞在沒有選擇物的情況下，得到擴增的基因可以穩定存在下去。
三、表達產物的分離、純化與鑒定
（一）大腸桿菌重組表達蛋白的分離、純化
大腸桿菌的分泌型蛋白和融合型蛋白的純化有所不同，分泌型表達蛋白的純化必須通過細胞的溶解、包涵體的分離、變性和折疊復性等步驟；而融合型表達蛋白除了以上個步驟外，由于是融合蛋白，所以必須在包涵體分離、變性以后在進行定點裂解以釋放重組的多肽并折疊復性。
1.大腸桿菌重組表達蛋白質分離的粗制品
一般步驟包括：離心收集菌體→ 超聲波破碎→離心收集上清 →熱處理變性→離心→上清用硫酸銨沉淀。
大腸桿菌經過離心濃縮以后可用機械磨碎法、超聲波處理法或溶菌酶加去污劑法將包涵體分離。在大腸桿菌表達產率過高，超出大腸桿菌的代謝水平時，表達產物累積起來，高濃度導致形成多聚體，然后形成包涵體。包涵體的形成和溶液pH值和蛋白質本身的溶解度有關；和蛋白質之間的離子鍵、疏水鍵或共價鍵等化學作用有關；和高溫培養條件有關。包涵體是蛋白質的聚合體，包含了表達的目的基因產物、大腸桿菌菌體蛋白成分、質粒編碼的蛋白、其他污染成分。溶解包涵體常用的變性劑有尿素、鹽酸胍、SDS等。一般的情況以超聲波處理方法為主。
對于融合蛋白來說，除了對包涵體的處理以外，還必須使其重組蛋白從中釋放。由于融合蛋白通常可以得到高效表達，且比較穩定，融合蛋白比多數菌體蛋白大，因此電泳中易于鑒定。盡管融合蛋白可大量產生，又易于純化，但在分離純化過程中必須進行定點裂解，以獲得感興趣的重組蛋白。定點裂解可用溴化氫裂解或蛋白酶水解方法。

重組蛋白的從包涵體中釋放是缺乏生物學活性的；一系列的純化過程中，處理的條件比較劇烈，使蛋白質高級結構破壞，因此重組蛋白的復性特別重要。蛋白質復性的原則是恢復其高級結構，并使之穩定，一般低濃度的尿素（3mol/L尿素），可使變形的蛋白質重新折疊。復性前提是蛋白質必須達到一定的純度，另外還與蛋白質的濃度、溫度、pH值及氧化還原劑條件等密切相關。
2.大腸桿菌重組表達蛋白質分離的精制品
大腸桿菌重組表達蛋白質分離的粗制品要經過凝膠層析、離子交換層析的純化，獲得相對的純品，獲得的純品然后還需經過活性、純度、和序列的測定加以確定。
（二）酵母重組表達蛋白的分離、純化
酵母重組表達蛋白的分離、純化分為兩種情況：酵母細胞內表達的蛋白質和蛋白分泌型：
1.酵母細胞內表達的重組蛋白質的分離純化
酵母細胞內表達的重組蛋白質的分離純化的過程比較簡單，以α-蛋白酶抑制劑的純化為例：收集酵母細胞→用玻璃珠破碎 →離心取上清→DEAE Sepharose層析柱→用0-0.3mol/L NaCl梯度洗脫→收集活性部分，濃縮→SephadexG75層析→收集活性部分，濃縮→SDS-PAGE純度鑒定達95%以上。
2.酵母表達分泌型重組蛋白的分離純化
以酵母表達干擾素純化為例：
發酵液用0.45μm孔徑的Milipore濾膜過濾濃縮→DEAE-Trisacryl
層析柱→用0-0.3mol/L NaCl梯度洗脫→收集干擾素部分→SephadexG75凝膠過濾→用50mmol/Limidazole，pH6.8洗脫 → 收集干擾素 →用水稀釋1倍→層析聚焦（Pharmacia,PBE94）緩沖液洗脫→干擾素電泳鑒定，純度大于95%，N-末端序列正確，二硫鍵結構和天然一致，總回收率為13%。
提高酵母表達系統重組蛋白的產量的方法是解聚技術：把聚合體變為單體的技術，相當于大腸桿菌的包涵體處理技術。聚合體在變性的條件下（4mmol/L尿素處理），凝膠過濾可得到較好的層析峰。SDS、加熱也不失為一種解聚的方法。
（三）CHO細胞的表達重組蛋白的純化、鑒定
CHO細胞收集、離心→取上清，加EDTA，貯存與-20℃→離子交換層析（S-Sepherose）→收集洗脫NT-3→洗脫液用超濾方法濃縮→凝膠過濾（Sephacryl S-100HR）→收集層析峰（含NT-3部分），并進行濃縮 →上反相HPLC層析柱（C18）→SDS-PAGE純度鑒定→HPLC層析峰中含NT-3部分進行序列分析。
（四）重組蛋白質分析鑒定基本要求
重組蛋白質的鑒定方法一般可以通用，但要根據不同的蛋白質選用其中部分進行運用：

重組蛋白質的鑒定方法及標準